ATP合成酵素の一次構造に基づく立体構造と機能の相関の解明

基于ATP合成酶的一级结构阐明三级结构与功能之间的关系

• 批准号: 02680136
• 负责人: 金沢 浩
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02680136/
• 关键词: ATP合成酵素(F_1F_0); 突起変異; もどり変異; PCR法; 一次構造と機能

本研究では,ATP合成酵素の一次構造に基づいた高次構造と機能の相関について次の2つの方法によって知見を得ることを目的とした。(1)大腸菌ATP合成酵素の機能欠損変異株より,機能の回復した戻り変異株を分離し,この変異を塩基配列レベルで明らかにする。(2)ATP合成酵素に対するモノクロ-ナル抗体を分離調製し,抗体認識部位を一次構造上で明らかにし,抗体のATP合成酵素に対する機能及び分子集合過程に対する効果を観察する。以上の2点に対して次の成果が猿られた。(1)本酵素の活性中心を有するβサブユニットのSer174残基がPheに変換し機能を失った変異株から戻り変異を多数分離した。PCR法を用いた新しい変異同定法を用いて,元の欠損変異が保たれた形で,新たにAla295Gly149,Lev400,Asu158,Ale167が変異し機能が回復することが明らかとなった。したがって,Ser194とこれらの残基がそれぞれ近傍に位置し,ATPaseの解媒活性に重要であることが示唆された。これまで推定された触媒部位(140〜350残基)の中及びこれとははずれる400残基に至る領域が,実際高次構造上相互に接近している可能性を,本研究成果は初めて示したものであり,重要な成果である。同様な手法を用いて,別の2種のβ変異株についてももどり変異を解析し,それぞれ残基の空間的配置について知見を得ることができた。第2のアプロ-チであるモノクロ-ナル抗体については,βサブユニットに強く結合する2種の抗体産生細膜を分離した。この2種の認識部位について,βサブユニットの部分ペプチドを産生する発現ベクタ-系を作製し詳しく解析した。その結果,これら抗体はβのN端1ー114残基中に認識部位をもち,ATPase活性は阻害せず,分子集合したATPaseに結合する。以上のことから,βのN端1ー114残基は,ATPase分子の外側に位置し触媒活性には関与しないことが明らかとなった。

In this study, the primary structure of ATP synthase is related to the secondary structure and function. (1)E. coli ATP synthase functional impairment mutant, functional recovery of mutant isolation, the mutant gene alignment is clear (2)ATP synthase related to the isolation and modulation of antibodies, antibody recognition site on the primary structure of the clear, antibody ATP synthase related to the function and molecular assembly process related to the effect of observation. The above two points are related to the results of the second time. (1)The active center of this enzyme has a β-residue and a Phe-174 residue. PCR method is used in the middle of the new, different and different methods, the original loss of the difference between the protection of the shape, the new Ala295Gly149,Lev400,Asu158,Ale167 between the difference between the function of the recovery. Ser194 is an important site for ATPase activity. The results of this study show that the catalytic sites (residues 140 ~ 350) are close to each other in high order structure. The same method is used to analyze the differences between the two kinds of β-variant plants, and the spatial arrangement of the residues is known. The second is the separation of two kinds of antibody production membranes. These two kinds of recognition parts are divided into three parts: β- As a result, the antibody binds to residues 1 - 114 at the N-terminal of the β-terminal, inhibiting ATPase activity and molecular assembly. The N-terminal residue 1 - 114 of β is the outer position of ATPase molecule.

项目成果

Y.Sakai,H.Kanazawa,M.Tsuda,T.Tsuchiya: "Rapidpuritication and characterization of F_1ーATPase of Vibrio Parahaemolyficus" Biochem.Biophys.Acta. 1018. 18-22 (1990)

Y.Sakai、H.Kanazawa、M.Tsuda、T.Tsuchiya：“副溶血弧菌 F_1-ATP 酶的快速纯化和表征”Biochem.Biophys.Acta 1018. 18-22 (1990)。

J.Miki,K.Fujiwara,M.Tsuda,T.Tsuchiya,H.Kanazawa: "Suppression mutations in the difective βsubunit of F_1ーATPase from Escheri chia coli" J.Biol.Chem.265. 21567-21572 (1990)

J.Miki、K.Fujiwara、M.Tsuda、T.Tsuchiya、H.Kanazawa：“大肠杆菌 F_1ーATP 酶缺陷 β 亚基的抑制突变”J.Biol.Chem.265（1990）。