权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

部位特異的変異法を用いたGsαタンパク質の機能の研究

利用定点诱变研究 Gsα 蛋白功能

基本信息

批准号：
02680152
负责人：
水島純子
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02680152/
关键词：
Gタンパク質アデニル酸シクラ-ゼ rasタンパク質

项目摘要

本年度は、まず大腸菌でのGsαタンパク質発現系の改良を行った。研究計画に記したTacプロモ-タ-を使ったGsα発現系では充分高いGsα活性が得られず,大腸菌全抽出液での活性測定が困難で、リコンビナントGsαを精製することが必要であった。そこで、我々はより強力なT7プロモ-タ-を用いた発現系を作製した。T7プロモ-タ-の下流にラットGsα cDNAを接続したプラスミドを、T7RNAポリメラ-ゼ遺伝子を持つ大腸菌に導入し,リコンビナントGsαタンパク質を発現させた。その結果,大腸菌全抽出液可溶性画分にGsα活性を確認することができた。リコンビナントGsαは,可溶性画分のSDSーPAGE電気泳動でもそのバンドを確認することができた。しかし,ウサギ肝臓より精製したGsαに比べると,リコンビナントのGsαの比活性は低く,発現したGsαのタンパク質のうち一部のみが本来のGsαタンパク質のコンホメ-ションをとるものと考えられた。今後この発現系での発現条件や抽出法等を改良することにより、より高い比活性のリコンビナントGsαタンパク質を得たいと考えている。Gsαとrasのアミノ酸配列を比較すると,Gsαの193番のセリン及び196番のアスパラギン酸は,それぞれrasタンパク質の35番のスレオニン及び38番のアスパラギン酸に対応する。rasタンパク質では,どちらかのアミノ酸残基をアラニンに変異するとrasタンパク質のトランスフォ-ム能及びGAP(GTP水解促進因子)に対する反応性が失われる。そこで我々は,Gsαタンパク質において193番のセリン及び196番のアスパラギン酸をそれぞれアラニンに変異した変異体を作製し、上記大腸菌発現系を用いて発現させた。現在そのGsα活性を測定しているところである。今後これらの変異がGTP結合活性,GTP水解活性に及ぼす影響も解析する予定である。また,哺乳動物細胞に変異Gsαを発現させその機能を解析する系の確立も計画している。

This year, the improvement of the quality development system for Escherichia coli was carried out. In the research project, it was noted that the Gsα activity was sufficiently high to obtain the Gsα activity, and the activities of Escherichia coli whole extracts were difficult to determine, so it was necessary to purify the Gs α. We have a very strong control system. T7 Promo-ta-'s downstream nilraket Gsα cDNA was connected to the plasmid and T7RNA Polimera-ta gene was introduced into E. coli, and the recombinant Gsα Tappa protein was discovered today. As a result, Gsα activity of soluble fraction of Escherichia coli whole extract was confirmed. The SDS PAGE electrokinetic analysis of soluble proteins was performed to confirm the presence of these proteins. The specific activity of Gs α is lower than that of Gs α, and the specific activity of Gs α is lower than that of Gs α. In the future, the development conditions and extraction methods of the system will be improved. Compared with the acid sequence of Gsα and ras, the acid sequence of Gsα at 193 and 196 is different, and the acid sequence of Gs α at 35 and 38 is different. Ras are characterized by a lack of reactivity due to the presence of acid residues and GAP(GTP hydrolysis promoter). In this case, G α α is the most important factor in the development of E. coli in China, and G α is the most important factor in the development of E. coli. Now the Gs alpha activity is measured. In the future, these differences will be determined based on GTP-binding activity,GTP hydrolysis activity, and their impact on molecular analysis. The analysis of the function of different Gsα in mammalian cells was established.