リポ酸結合による酵素のホロ化機構の研究

硫辛酸结合酶空化机制研究

• 批准号: 03670125
• 负责人: 藤原 和子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03670125/
• 关键词: グリシン開裂酵素系; リポ酸; リポ酸転移酵素; ホロ蛋白質; アポ蛋白質; 部位特異的突然変異誘発; 大量発現

脊椎動物にはリポ酸を補欠分子族として持つ蛋白として4種類の蛋白が知られている。それらはグリシン開裂酵素系のH蛋白及び3種類のα-ケト酸脱水素酵素複合体のアシル基転移酵素成分(E2)である。今回,ウシH蛋白を用いて,そのリポ酸化の機構について研究し,以下の成果を得た。1.H蛋白と各種のE2とアミノ酸配列を比較すると,H蛋白のリポ酸結合部位(Lysー59)周辺にはお互いよく保存されているアミノ酸が見出だされた(Glyー43,Gluー56,Gluー63,Glyー70)。これらのアミノ酸を部位特異的変異法によって置換し,その置換がリポ酸結合に及ぼす影響について調べた。その結果,これらのアミノ酸のうち,特にGluー56とGlyー70を置換した場合にリポ酸結合の効率が著しく低下し,リポ酸結合におけるこれらのアミノ酸の重要性が示唆された。2.リポ酸結合の機構を詳しく調べるには,まずリポ受容体となるアポH蛋白を得る必要がある。我々は先にウシH蛋白の前駆体の全遺伝情報を含むcDNAを単離しているので,これから成熟型H蛋白を合成するプラスミドベクタ-を構築し,それを大腸菌に挿入して大量発現させた。大腸菌をリポ酸を添加した培養液中で成育させたときH蛋白はリポ酸の結合していないアポH蛋白(80%),リポ酸の結合したホロH蛋白(10%),それにオクタン酸が結合した異常型(10%)の3タイプが合成されていた。一方,リポ酸を結合したホロH蛋白(10%),それにオクタン酸が結合した異常型(10%)の3タイプのH蛋白をそれぞれ単一に精製し,ペプチドマッピングによってLysー59の修飾を確認した。今後,このアポH蛋白をリポ酸の受容体として用いて,リポ酸転移酵素を精製し,その反応機構を解明する。

Vertebrate に は リ ポ acid を fill owe molecular family と し て hold つ protein と し て 4 kinds の protein が know ら れ て い る. そ れ ら は グ リ シ ン craze is の H protein enzymes and び 3 kinds の alpha ケ ト acid dehydration vegetable enzyme complex の ア シ ル base planning shift enzyme components (E2) で あ る. Today back, ウ シ H protein を with い て, そ の リ ポ acidification の institutions に つ い し て study, the following た を の achievements. 1. H と various の E2 protein と ア ミ ノ acid with column を compare す る と, H protein の リ ポ acid binding site (Lys ー 59) weeks 辺 に は お mutual い よ く save さ れ て い る ア ミ ノ acid が see out だ さ れ た (Gly ー 43, Glu ー 56, Glu ー 63, Gly ー 70). こ れ ら の ア ミ ノ acid を site specific - different に よ っ て replacement し, そ の replacement が リ ポ acid combined with に and ぼ す influence に つ い て adjustable べ た. そ の results, こ れ ら の ア ミ ノ acid の う ち, trevor に Glu ー 56 と Gly ー 70 を replacement し た occasions に リ ポ acid combined with の が the working rate し く し, リ ポ acid combined with に お け る こ れ ら の ア ミ ノ acid の importance が in stopping さ れ た. 2. リ ポ acid combined with の institutions を detailed し く adjustable べ る に は, ま ず リ ポ by let body と な る ア ポ H protein を る necessarily が あ る. I 々 は に first ウ シ H protein の 駆 の whole body before heritage 伝 intelligence を containing む cDNA を 単 from し て い る の で, こ れ か ら mature を H protein synthesis す る プ ラ ス ミ ド ベ ク タ - を build し そ れ を coliform に scions into し て large 発 now さ せ た. Coliform を リ ポ acid を add し た medium, で into yukon さ せ た と き H protein は リ ポ acid の し て い な い ア ポ H protein (80%), リ ポ acid の し た ホ ロ H protein (10%), そ れ に オ ク タ ン acid が し た exception type (10%) の 3 タ イ プ が synthetic さ れ て い た. Side, リ ポ acid を し た ホ ロ H protein (10%), そ れ に オ ク タ ン acid が し た exception type (10%), 3 タ の イ プ の H protein を そ れ ぞ れ 単 に refined し, ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に よ っ て Lys ー 59 の modified を confirm し た. In the future, こ の ア ポ H protein を リ の ポ acid by let body と し て in い て, リ ポ acid を refined し, planning to move enzyme そ の を 応 authorities interpret す る.