T3ファ-ジin vitro DNA詰込み系を用いたDNA構造解析法の開発

利用T3噬菌体体外DNA包装系统开发DNA结构分析方法

• 批准号: 03680218
• 负责人: 藤澤 久雄
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03680218/
• 关键词: T3ファ-ジ-; in vitro DNA詰込み; 段階的欠損導入; 長大DNA; 構造解析

T3ファ-ジの精製in vitro DNA詰込み系は線状DNAを同調的に頭殼内へ詰込む。詰込まれたDNAはDNaseで消化されないので,詰込み反応開始後,経時的に反応液をDNase処理すると,DNAに段階的欠損を導入出来る。このT3ファ-ジ精製in vitro系を用いて,長大DNAに段階的欠損を導入して構造を解析する方法を確立することを目指した。COS配列の両側に異なった薬剤耐性遺伝子(Cm^r,Amp^r)と複製起点(oriーI,oriー2)及びクロ-ニング座位をもつプラスミドベクタ-を構築し,ヒトDNA断片(25kb)を挿入後,入タ-ミナ-ゼによりcos座位で切断,線状化して詰込みの 基質に用いた。反応開始後3,7及び10分にDNase処理し,環状化して得たプラスミドを用いてE.coliを形質転換し,それぞれの薬剤で選択し,形質転換細胞からプラスミドDNAを調整した。制限酵素Pst Iで切断して,DNAの分子量を逑めると,Ampで選択した場合,分子量22kbを最長とする種々の長さのDNAが得られ,その制限酵素地図を決定出来た。Cmで選択すると,10kb以上のDNAを得ることは出来なかった。逆方向に挿入された同一ヒトDNA断片をもつクロ-ンを用いて,Cm選択による実験を行なったところ,22kb DNAを得たが,Amp選択では10kb DNAしか得られなかった。得られた欠失プラスミドDNAの塩基配列を決め,最初に詰込まれたDNA端(COS配列)はDNaseにより消化されていないことが確認出来た。T3ファ-ジin vitro DNA詰込み系を用いると,容易に長大DNAの制限酵素地図を構築出来ることが判った。それぞれの制限酵素DNA断片について種々の欠失の入ったセットを得ることが出来るので,塩基配列も決定出来るはずである。今回,はからずも示されたように,用いるDNAによりクロ-ニングの困難な場合がある。DNA詰込み反応以降の諸条件し環状化,形質転換等)の検討が必要である。

T3ファ-ジ refined in vitro DNA 込み in に capsid へ 込む homologous to へ linear DNAを. Wall 込 ま れ た DNA は DNase で digestion さ れ な い の で, wall 込 み 応 began, when 経 に anti 応 liquid を DNase 処 Richard す る と, DNA に る Duan Jie owe loss を import. こ の T3 フ ァ - ジ refined in vitro を with い て, grew up DNA に Duan Jie owe loss を import し て tectonic analytical す を を る method established す る こ と を refers し た. COS match column の struck side に different な っ た 薬 tonic patience heritage 伝 child (Cm ^ r, Amp ^ r) と copy starting point (ori ー I, ori ー 2) and び ク ロ - ニ ン グ seat を も つ プ ラ ス ミ ド ベ ク タ - を build し ヒ ト DNA fragment (25 KB) を scions into, into the タ - ミ ナ - ゼ に よ り COS seat で cut, linear change し て wall The 込み 込み matrix に is used with 込み た. Anti 応 began after 3, 7 and 10 points に び DNase 処 し, annular turn し て must た プ ラ ス ミ ド を with い て e.c. with our fabrication: oli を form quality planning in し, そ れ ぞ れ の 薬 tonic で sentaku し, form quality planning in cell か ら プ ラ ス ミ ド DNA を adjustment し た. Limitations enzyme Pst で I cut し て, DNA molecular weight の を qiu め る と, Amp で sentaku し た occasions, the molecular weight of 22 KB を longest と す る kind 々 の long さ の DNA が so ら れ, そ limitations の enzymes to 図 を た decision. For Cmで, select 択すると. For more than 10kb of <s:1> DNAを, る な と った will be obtained, and な な った. Inverse direction に scions into さ れ た same ヒ ト DNA fragment を も つ ク ロ - ン を with い て, Cm sentaku に よ る be 験 を line な っ た と こ ろ, 22 KB DNA を so た が, Amp sentaku で は 10 KB DNA し か have ら れ な か っ た. Have ら れ た owe lost プ ラ ス ミ ド DNA の salt base with column を め, initially に wall 込 ま れ た DNA (COS match column) は DNase に よ り digestion さ れ て い な い こ と が identified た. T3 フ ァ - ジ in vitro DNA wall 込 を み department with い る と, easy に grew up the limitations の DNA enzymes to 図 を build out る こ と が convicted っ た. Limitations そ れ ぞ れ の enzyme DNA fragment に つ い て kind 々 の owe の loss into っ た セ ッ ト を have る こ と が out る の で, salt base with column も decision out る は ず で あ る. Today back, は か ら ず も shown さ れ た よ う に, use い る DNA に よ り ク ロ - ニ ン グ の difficult な occasions が あ る. The 込み reaction of DNA to 応 and the subsequent <s:1> conditions for ring-shaped transformation, morphogenesis 転 transformation, etc., <s:1> 検 to seek が is necessary である.

项目成果

Hashimoto,C.: "DNA sequences necessary for packaging of packaging of bacteriophage T3" VIROLOGY. 187. (1992)

Hashimoto,C.：“噬菌体 T3 包装所需的 DNA 序列”病毒学。

Kimura,M.: "Dissection of functional domains of the packaging protein of bacteriophage T3 by siteーdirected mutagenesis" VIROLOGY. 180. 709-715 (1991)

Kimura, M.：“通过定点诱变对噬菌体 T3 包装蛋白的功能域进行剖析”VIROLOGY 180. 709-715 (1991)。

Fujisawa,H.: "Analysis of interactions among factors involved in the bacteriophage T3 DNA packaging in a defined in vitro system" VIROLOGY. 185. 788-794 (1991)

Fujisawa, H.：“分析特定体外系统中参与噬菌体 T3 DNA 包装的因素之间的相互作用”病毒学。

Valpuesta,J.M.: "Threeーdimensional structureof T3 connector purified from overーexpressing bacteria" J.Mol.Biol.(1992)

Valpuesta, J.M.：“从过度表达细菌中纯化的 T3 连接器的三维结构”J.Mol.Biol.(1992)