魚類シトクロムP-450cDNAを用いた環境汚染判定法の開発

鱼类细胞色素P-450 cDNA测定环境污染方法的建立

• 批准号: 05760165
• 负责人: 大嶋 雄治
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760165/
• 关键词: P-450; 環境汚染; 指標; 魚; DNA; PCR

マコガレイP-450遺伝子の増幅:既に塩基配列の判明しているウナギP-450遺伝子の情報を基に、PCRプライマーを作制した。次いでマコガレイ肝臓より全DNAを抽出し、cDNAを鋳型としてPCRによりP-450遺伝子を増幅したが、目的の遺伝子は増幅しなかった。本原因として、P-450をコードする遺伝子の中に、イントロン(非翻訳部分)があるため、増幅されなかったと考えられた。よって、生きたウナギの肝臓よりmRNAを抽出後、DNAに逆転写を行った後、PCR(RT-PCR)を行った結果、約300bps付近にDNAが増幅された。よって、このDNAを精製し、ダイレクトシーケンス法によりその塩基配列を決定した。環境調査: 九州北部博多湾内で、汚染された水域および清浄な水域よりマコガレイを計10個体釣りにより採取した。肝臓は現場で直ちに抽出して液体窒素で凍結、-80℃で保存した。肝臓の細胞分画を行い、P-450含量とその酵素活性を測定した結果、P-450含量およびP-450によって触媒されるbenzo[a]pyrene hydroxylaseの活性は、汚染魚で対象魚にくらべ有意(p<0.01)に高かった。しかし、肝臓よりmRNAを抽出しRT-PCRを行ったが目的とするDNAは検出されなかった。以上の結果より、汚染されたマコガレイの肝臓におけるP-450含量は高く、誘導が起こっていたと考えられる。また、P-450のmRNAが検出されなかった原因は採集、凍結、保存(-80度)時にmRNAが分解されたと推定された。本研究の結果、環境汚染によるマコガレイのP-450の誘導が明らかとなった。今後は、再度マコガレイの採取を行い、生きた魚よりmRNAを抽出、RT-PCRによってP-450mRNAの発現を明らかにして行く予定である。

P-450 gene amplification: both base alignment and identification of P-450 gene amplification, PCR amplification In the next step, the entire DNA was extracted, the cDNA was cloned and the P-450 gene was amplified by PCR, and the target gene was amplified. The reason for this is that the P-450 has a long history and a long history. After mRNA extraction, DNA reverse transcription and PCR(RT-PCR) were performed, and DNA amplification was performed at about 300bps. DNA purification, DNA sequencing and DNA sequencing Environmental survey: 10 individual fish collected from polluted waters in Hakata Bay, northern Kyushu The liver is frozen and stored at-80℃. The activity of benzo[a]pyrene hydroxylase in liver cells, P-450 content and enzyme activity were determined. The activity of benzo[a]pyrene hydroxylase in P-450 and P-450 was significantly higher than that in fish contaminated with phosphorus (p<0.01). The mRNA of the liver was extracted and the DNA was extracted. The above results show that the P-450 content in the liver is high, and the P-450 content is high. The reason why P-450 mRNA was detected was that mRNA was decomposed when it was collected, frozen and stored at-80 ℃. The results of this study, environmental pollution, P-450 induction and development. In the future, the production of P-450mRNA will be determined by RT-PCR.