海水中の特定の微生物グループを検出、計数するためのプローブ法に関する研究

点击翻译按钮获取中文摘要

海洋中の細菌群集は有機物の分解に中心的な役割を果たしているが、その具体的なプロセスの解析は未だ充分にはなされていない。特にそれぞれの微生物が現場でどのような機能を発現しているかといった問題は、これまで方法論的な限界から全く手付かずの状態である。本研究では申請者がこの数年来行ってきた遺伝子プローブを用いたハイブリダイゼーション法の応用により、微生物の個々の細胞内での遺伝子の発現過程をmRNAの検出で捉えようとした。実験は大腸菌betaガラクトシダーゼのmRNAを対象遺伝子として、国立遺伝研究所遺伝子データベースによる検索を行い、2種のオリゴヌクレオチデプローブgal-1(TGTTATCCGCTCACAATT)、gal-2(CGTAATCATGGTCATAGC)を合成した。それぞれのプローブの末端にビオチンを付加した。大腸菌はグルコース添加による培養と無添加の培養の2種類を調整した。すなわち、基礎培地として(KH_2PO_4,2g;K_2HPO_4,7g;(NH_4)SO_4,1g;MgCl_26H_2O,0、1gカザミノ酸、2、5g/1literpH.7.2)を用い、実験群には2、5mM ニトロフェニルガラクトピラノシドを添加、対象群にはさらに20mMのグルコースを添加した。実験群のみbetaガラクトシダーゼの発現によりニトロフェノールが生成し培地が黄色を呈した。それら2種の菌に対して合成プローブによるインサイチューハイブリダイゼーションを現在行っている。