発光ダイオード検出系を用いた特定細菌群集計数の自動化

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バイオプローラーで特定細菌の検出を行う場合、総菌数計数のために細菌体の対比染色を行う。これまで、対比染色用栄光色素としてDAPIを用いてきた。今回、より多種の蛍光色素を利用する目的で、新たにプロピディウムアイオダイド(PI)の使用を考えた。培養細菌(大腸菌)を用いた蛍光顕微鏡観察により、PI染色濃度を決定した。その結果、10μg/mlのPI染色により、細菌体は充分に染色され、顕微鏡像も鮮明であった。これまでの実験結果から、バイオプローラーによるFluorescence in situ hybridizationでは、通常のCy3未端標識の蛍光オリゴヌクレオチドプローブでは、検出に充分な蛍光強度を得られない。そこで、本年は、CARD-FISH法による蛍光強度の増感を試みた。TSA増感システムに利用できる、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドプローブを新たに合成した。プローブはそれぞれ、真正細菌共通のEUB338-biotin、プローブの非特異吸着を検定するための、NON338=blotin、大腸菌検出用のEc637-biotin、さらには、コレラ菌検出用のCH01-biotin, CH02-biotinである。コレラ菌の検出実験を行うため、東京湾からコレラ近縁細菌の分離を行った。東京湾晴海ふ頭より採取した海水100mlを0.2μm孔径のヌクルポアフィルターによりろ過した。ろ過フィルターは、TCBS寒天培地に貼り付け、35℃で3日間培養した。緑色、黄色の多数の細菌コロニーを確認した。このうち、コレラ近縁と思われる黄色コロニーを計50株分離した。これら分離株は、さらにクロモアガー寒天培地による形成コロニー色の判別を行い。現在までに3株のコレラ近縁と推定される菌株を得ている。