ヒトalpha-ガラクトシダーゼのシグナル配列除去におけるアミノ酸置換の影響

氨基酸取代对人α-半乳糖苷酶信号序列去除的影响

• 批准号: 05770111
• 负责人: 石井 達
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770111/
• 关键词: alpha-ガラクトシダーゼ; シグナル配列; アミノ酸置換

ファブリー病は リソソーム酵素であるalpha-ガラクトシダーゼ(alpha-Gal)の遺伝的欠陥により生じる疾患であり、その臨床像の違いにより古典型と亜型とに分類されている。これまで我々は、ファブリー病患者の遺伝子解析から亜型患者の変異がエクソン6のアミノ酸置換であることを確認した。そこで、これら変異alpha-GalをCOS1細胞で発現させ、^<35>S-メチオニンを用いてパルス-チェイス実験を行った。正常alpha-Galは48kDaの前駆体から46kDaの成熟体へと変化するが、これら変異alpha-Galは48kDaのままであった。そこで私は、本酵素のシグナル配列除去にこれらエクソン6のアミノ酸置換が影響し、プロセシングを遅らせ、その結果細胞内での残在活性の低下をひきおこしていると考えた。そこでまず、alpha-Galのシグナル配列をalpha-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(alpha-NAGA)のシグナル配列と入れかえたキメラ酵素を作成し検討した。alpha-NAGAはalpha-Galと同じ、リソソーム酵素であり、アミノ酸配列で約50%の相同性を持ち、特にシグナルが除去された成熟体のN-末端配列は良く一致している。しかし、シグナル配列はその長さも異なっている。alpha-Galのシグナル配列が31残基、alpha-NAGAのそれは17残基で約1/2と短く相同する残基もわずか2残基である。まず、正常alpha-Galについてシグナル配列を変えたキメラ酵素をCOS1細胞で発現させたところ、正常alpha-Galの約1/4と低置ではあるが、細胞内外でその活性が認められた。そこで次にこのキメラとエクソン6のアミノ酸置換を組み合わせた変異体を作成し、COS1細胞で発現させたところ、エクソン6のアミノ酸置換の影響は、シグナル配列にかかわらず、一定の割合で活性を低下させることがわかった。このことは、エクソン6のアミノ酸置換は直接はシグナル配列と相互作用していないことを示している。また、これまでに我々は、独自にエクソン6のアミノ酸置換体をバキュロウイルス・昆虫細胞系で発現精製した酵素の性質から、これらアミノ酸置換体は中性pHで熱不安定なタンパク質であることがわかった。しかも、この失活は、ガラクトースの添加により抑えることができ、変異体の活性も上昇する。シグナル配列を変えたキメラalpha-Galもガラクトース添加により活性上昇したことから、細胞内で熱による失活が生じていることがわかった。今回の実験ではエクソン6のアミノ酸置換とシグナル配列との関連性は否定されたが、失活とシグナル配列との関連性を示唆する結果が得られた。

There are many diseases caused by the deficiency of the alpha-gracutt sidāna (alpha-Gal) gene of the anti-inflammatory enzyme, and the clinical manifestations of the disease are classified into classical and classical types. The gene analysis of the patients with this disease was confirmed by the analysis of the gene sequence of the patients with this disease. In addition to the above, we also found that the COS1 cell line was not suitable for the treatment of patients<35>. Normal alpha-Gal is 48kDa precursor, 46kDa mature, and 48kDa variant. In addition, the activity of the enzyme in the cell was decreased due to the effect of acid substitution on the enzyme. Alpha-Gal is the most important element in the alpha-NAGA system. Alpha-NAGA has about 50% identity to alpha-Gal and its amino acid sequence except for the N-terminal sequence of the mature form. The number of people in the United States who have been detained for a long time is different. Alpha-Gal and alpha-NAGA have 31 residues and 17 residues, respectively. Normal alpha-Gal is about 1/4 of normal alpha-Gal and its activity in and out of COS1 cells is recognized. The effect of acid substitution on COS1 cells was studied. The results showed that the activity of acid substitution in COS1 cells was lower than that in COS 1 cells. This is a direct reaction to acid substitution. The properties of purified enzymes developed in insect cell lines are different from those of neutral pH, thermally labile, and stable enzymes. The activity of the enzyme is increased by increasing the activity of the enzyme. In addition, the activity increases, and the intracellular heat is inactivated. The results of the present study show that the correlation between the acid substitution and the group alignment of the six groups is negative, and the correlation between the inactivation and the group alignment is negative.

项目成果

Ishii,S.,et al.: "Characterization of a mutant alpha-galactosidase gene product for ・・・・・・" Biochem.Biophys.Res.Commun.197. 1585-1589 (1993)

Ishii, S. 等人：“突变型 α-半乳糖苷酶基因产物的表征……”Biochem.Biophys.Res.Commun.197 1585-1589 (1993)。