細菌内毒素によるマクロファージ活性化を制御する血清因子についての解析

细菌内毒素控制巨噬细胞活化的血清因素分析

基本信息

批准号：
05770194
负责人：
切替照雄
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770194/
关键词：
内毒素 LPS 血清 CD14 マクロファージ TNF NO

项目摘要

細菌内毒素(LPS)が、どのようにマクロファージに認識され、マクロファージを活性化するのかを明らかにする目的で本研究を実施した。我々は最近マウスマクロファージ細胞株J774.1細胞由来で、1251-LPSの特異的結合が署名に低下した変異株J7.DEF3細胞を分離したので、まずこれらの細胞の生物学的解析をした。この変異株は、モノクロナール抗体を用いたFACS解析からCD14の発現が欠損していること、しかしCD14cDNAプローブをもちいたノーザンブロット解析からCD14mRNAの発現は正常であることが分かった。この変異株は血清の有無に関わらずLPSに反応してTNFやNOを産生した。血清の存在下では、親株に比べ反応性が低下していた。血清の非存在下では親株も反応性は低下したが、この変異株は血清存在下と同様に反応し、その反応性は親株と同じであった。また、LPS以外の刺激物に対する反応性は、親株と変異株で全く差異はなかった。これらの解析からマクロファージのLPSに対する反応性には2種類あり、1つは血清およびCD14抗原依存性の反応であることがわかった。そこでこの血清およびCD14抗原依存性のLPS反応性の機能を解析するため、糖鎖の長さの異なるLPSを用いて、その反応性を検討した。その結果、S型LPSで刺激した場合、変異株のLPS反応性は約300倍低下していたが、Re型LPSやリピドAで刺激した場合この反応性の低下は高々5倍程度であった。これらの結果は、血清およびCD14抗原依存性の経路がS型LPSの活性中心を効率的にLPS受容体に提示する働きがあることを示唆している。この血清因子は易熱性で30-60%の硫安で塩析されるタンパク質で陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル漉過などにより、700倍まで精製した。

进行了这项研究是为了阐明细菌内毒素（LPS）如何通过巨噬细胞识别并激活巨噬细胞。我们最近分离了源自小鼠巨噬细胞系J774.1的突变体J7.DEF3细胞，其中将1251-LP的特异性结合还原为签名，因此我们首先对这些细胞进行了生物学分析。发现该突变体使用单克隆抗体在FACS分析中具有CD14表达缺陷，但是从带有CD14 cDNA探针的Northern blot分析中，发现它的CD14 mRNA正常表达。这种突变体对LP产生了TNF，而不论血清是否存在。在存在血清的情况下，与母体应变相比，反应性降低。尽管在缺乏血清的情况下，母体菌株的反应性也降低，但该突变株的反应方式与血清的存在相同，其反应性与父菌株的反应性相同。此外，母体应变和突变菌株之间对LPS以外的兴奋剂反应性没有差异。这些分析表明，巨噬细胞对LPS有两种类型的反应性，一种是血清和CD14抗原依赖性反应。因此，为了分析血清和CD14抗原依赖性LPS反应性的功能，使用具有不同糖链长度的LPS检查了反应性。结果，当用S型LPS刺激时，突变菌株的LPS反应性降低了约300次，但是当用Re-Type LPS或脂质A刺激时，反应性的降低最多约为5倍。这些结果表明，血清和CD14抗原依赖性途径有效地将S型LPS的活性中心呈现给LPS受体。该血清因子是耐热的，并以30-60％的硫酸铵盐分盐分，并通过阴离子交换柱，阳离子交换柱，凝胶过滤等纯化至700次。