A.actinomycetemcomitansの線維芽細胞抑制因子のクローニング

申請者は、Actinobacillus actinomycetemcomitansY4株の細胞質内画分から、線維芽細胞抑制因子(FIF)の精製を行い、分子量50kDaで、in vitroにおいてヒト歯肉線維芽細胞の増殖を著しく抑制することを明らかにした(FEMS Microbiology Letters107(1993)111-114)。精製したFIFのN-末端アミノ酸配列を調べた結果、Met-Asn-Ile-X-Gln-Leu-Gln-Ala-Ile-Asp-Gln-Val-Ala-X-Tyr-Val-X-X-Ileと確認された。N-末端アミノ酸配列から、これに相当する合成DNAを作製し、A.actinomycetemcomitansY4株から染色体DNAを分離後、制限酵素処理に断片化し、合成DNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼイション法により、FIFを含むDNA断片の検索を行った。合成DNAについては、N-末端より8番目から13番目、つまりAla-Ile-Asp-Gln-Val-Alaに相当すると考えられるDNAを作製した。コドン使用については、Kraig等により報告されたA.actinomycetemcomitansJP2株のロイコトキシンのDNAシークエンスの結果を参考にして、5^1-GCXATTGATCAAGTXGC-3^1(X; イノシン)を作製した。Smith等の方法に準じてA.actinomycetemcomitansY4から染色体DNAを分離後、Bam HIあるいはHindIIIにて完全分解させ、合成プローブを^<32>P-gammaATPを用いてラベルし、通法に従いサザンハイブリダイゼエーションを行った。この結果、Bam HI及びHindIIIを用いた場合、各々2.5kb、2.2kbのDNA断片が確認された。確認されたDNA断片を回収後、各々ベクターpHSG 399に挿入し、現在制限酵素地図の作製中である。今後、E.coliにおけるFIFの発現を確認すると共に順次サブクローニングを行い、FIFのDNAシークエンスをする予定である。

申請者は、Actinobacillus actinomycetemcomitansY4株の細胞質内画分から、線維芽細胞抑制因子(FIF)の精製を行い、分子量50kDaで、in vitroにおいてヒト歯肉線維芽細胞の増殖を著しく抑制することを明らかにした(FEMS Microbiology Letters107(1993)111-114)。精製したFIFのN-末端アミノ酸配列を調べた結果、Met-Asn-Ile-X-Gln-Leu-Gln-Ala-Ile-Asp-Gln-Val-Ala-X-Tyr-Val-X-X-Ileと確認された。N-末端アミノ酸配列から、これに相当する合成DNAを作製し、A.actinomycetemcomitansY4株から染色体DNAを分離後、制限酵素処理に断片化し、合成DNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼイション法により、FIFを含むDNA断片の検索を行った。合成DNAについては、N-末端より8番目から13番目、つまりAla-Ile-Asp-Gln-Val-Alaに相当すると考えられるDNAを作製した。コドン使用については、Kraig等により報告されたA.actinomycetemcomitansJP2株のロイコトキシンのDNAシークエンスの結果を参考にして、5^1-GCXATTGATCAAGTXGC-3^1(X; イノシン)を作製した。Smith等の方法に準じてA.actinomycetemcomitansY4から染色体DNAを分離後、Bam HIあるいはHindIIIにて完全分解させ、合成プローブを^<32>P-gammaATPを用いてラベルし、通法に従いサザンハイブリダイゼエーションを行った。この結果、Bam HI及びHindIIIを用いた場合、各々2.5kb、2.2kbのDNA断片が確認された。確認されたDNA断片を回収後、各々ベクターpHSG 399に挿入し、現在制限酵素地図の作製中である。今後、E.coliにおけるFIFの発現を確認すると共に順次サブクローニングを行い、FIFのDNAシークエンスをする予定である。