A.actinomycetemcomitansの線維芽細胞抑制因子のクローニング

伴放线放线菌成纤维细胞抑制因子的克隆

• 批准号: 05771601
• 负责人: 片岡 正俊
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771601/
• 关键词: 歯周病; 線維芽細胞抑制因子; Actinobacillus actinomycetemcomitans; 遺伝子クローニング

申請者は、Actinobacillus actinomycetemcomitansY4株の細胞質内画分から、線維芽細胞抑制因子(FIF)の精製を行い、分子量50kDaで、in vitroにおいてヒト歯肉線維芽細胞の増殖を著しく抑制することを明らかにした(FEMS Microbiology Letters107(1993)111-114)。精製したFIFのN-末端アミノ酸配列を調べた結果、Met-Asn-Ile-X-Gln-Leu-Gln-Ala-Ile-Asp-Gln-Val-Ala-X-Tyr-Val-X-X-Ileと確認された。N-末端アミノ酸配列から、これに相当する合成DNAを作製し、A.actinomycetemcomitansY4株から染色体DNAを分離後、制限酵素処理に断片化し、合成DNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼイション法により、FIFを含むDNA断片の検索を行った。合成DNAについては、N-末端より8番目から13番目、つまりAla-Ile-Asp-Gln-Val-Alaに相当すると考えられるDNAを作製した。コドン使用については、Kraig等により報告されたA.actinomycetemcomitansJP2株のロイコトキシンのDNAシークエンスの結果を参考にして、5^1-GCXATTGATCAAGTXGC-3^1(X; イノシン)を作製した。Smith等の方法に準じてA.actinomycetemcomitansY4から染色体DNAを分離後、Bam HIあるいはHindIIIにて完全分解させ、合成プローブを^<32>P-gammaATPを用いてラベルし、通法に従いサザンハイブリダイゼエーションを行った。この結果、Bam HI及びHindIIIを用いた場合、各々2.5kb、2.2kbのDNA断片が確認された。確認されたDNA断片を回収後、各々ベクターpHSG 399に挿入し、現在制限酵素地図の作製中である。今後、E.coliにおけるFIFの発現を確認すると共に順次サブクローニングを行い、FIFのDNAシークエンスをする予定である。

The applicant submitted four Actinobacillus actinomycetemcomitans Y strains for purification of FIF, molecular weight of 50kDa, in vitro inhibition of proliferation of FIF (FEMS Microbiology Letters107(1993)111-114). The N-terminal amino acid sequence of FIF was adjusted and Met-Asn-Ile-X-Gln-Leu-Gln-Ala-Ile-Asp-Gln-Val-Ala-X-Tyr-Val-X-X-Ile was confirmed. N-terminal amino acid sequence analysis, DNA fragment analysis, FIF analysis, DNA fragment analysis Synthetic DNA is produced by the N-terminal sequence 8 - 13, Ala-Ile-Asp-Gln-Val-Ala sequence. The results of DNA sequencing of A. actinomycetemcomitans JP2 strain were reported by Kraig et al. for reference. 5^1-GCXATTGCAAGTXGC-3^1(X; X) was prepared. Smith et al.'s method was used to isolate A. actinomycetemcomitans Y4, complete decomposition of HindIII, and synthesis of <32>P-gamma ATP. The results showed that Bam HI and HindIII DNA fragments of 2.5kb and 2.2kb respectively were identified. After the DNA fragment was recovered, the enzyme was detected at pHSG 399, and the enzyme was under control. In the future, FIF discovery in E.coli will be confirmed and FIF DNA discovery will be determined.