海洋性ビブリオ菌鞭毛モーターのエネルギー変換ユニットの遺伝子解析

海洋弧菌鞭毛运动能量转换单元的遗传分析

基本信息

批准号：
05780474
负责人：
川岸郁朗
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細菌鞭毛モーターは、細胞膜を横切るイオン流を鞭毛の回転運動に変換する分子機械である。最近当研究室では、海洋性ビブリオ菌の極毛と側毛という二種類の鞭毛モーターが、それぞれNa^+およびH^+によって駆動されることを見いだした。一つの細菌のもつ、共役イオンの異なるモーターの遺伝子を比較・解析すれば、エネルギー変換機構について重要な情報が得られると期待される。本研究では、まず、海洋性ビブリオ菌Vibrio alginolyticus野性株138-2とリファンピシン耐性株VIK2の細胞内に、エレクトロポレーション法を用いてプラスミドを移入する系を確立した。ベクターとしては、大腸菌ベクターP15Aレプリコンをもつプラスミドを用いると、ビブリオ菌中で安定に保持されることを見いだした。選択には、クロラムフェニコール・テトラサイクリンなどが使えることがわかった。さらに、この菌がヌクレアーゼを菌体外に排出していることを見いだした。そこで、浸透圧ショックを与えてペリプラズム領域のヌクレアーゼを取り除いた菌を用いたところ、形質転換効率が約十倍上昇した。この他、受容菌は対数増殖期後期まで培養し、菌体を洗浄するときには、溶菌を避けるため5-10mM Mg^<2+>存在下で行った。電気パルスは5.0-7.5kV/cmの範囲で与えた。以上の条件のとき最も形質転換効率が高く、DNA1mug当たり10^5程度の形質転換体が得られた。これと並行して、野性株とリファンピシン耐性株から、紫外線照射や異変誘発剤を用いて、側毛欠損株を数株単離した。さらに、これらの株から極毛の形成・回転・回転方向制御能の欠損した株を多数単離した。現在、これらの株を受容菌として、極毛機能の欠損を相補するビブリオ菌DNA断片のクローン化を試みている。

细菌鞭毛电动机是一种分子机，将离子流穿过细胞膜转换为鞭毛的旋转运动。最近，我们的实验室发现，海洋弧菌细菌的两种类型的鞭毛电动机，极性和侧毛是由Na^+和H^+驱动的。比较和分析一种细菌共轭离子的不同电机的基因，预计将获得有关能量转化机制的重要信息。在这项研究中，我们首先建立了一个系统，在该系统中，使用电穿孔将质粒转移到海洋弧菌细菌野生菌株138-2和利福平抗性菌株VIK2的海洋颤音细菌中。作为载体，发现使用携带大肠杆菌载体p15a复制子的质粒时，它稳定地保留在弧菌细菌中。已经发现氯霉素，四环素等可用于选择。此外，发现该细菌在细菌外排出核酸酶。因此，当使用经过渗透性休克以从周质区域去除核酸酶的细菌时，转化效率提高了约十倍。此外，将受体细菌培养到对数晚期生长阶段，在洗涤细胞时，它们是在5-10 mm mg^<2+>存在下进行的，以避免裂解。电脉冲在5.0-7.5kV/cm的范围内给出。在上述条件下，转化效率最高，并且获得了每杯DNA约10^5的转化子。同时，使用紫外线辐照或诱导异常的剂从野生和利福平抗菌菌株中分离出几种无毛菌株的菌株。此外，从这些菌株中隔离了许多缺乏控制极性头发形成，旋转和旋转方向的能力的菌株。当前，我们正在尝试使用这些菌株作为受体细菌来补充极端头发功能中的缺陷。