遺伝子工学的手法によるTSH受容体の構造解析と受容体抗体の作用機序に関する研究

利用基因工程方法分析TSH受体的结构及受体抗体的作用机制研究

• 批准号: 05857109
• 负责人: 吉田 正
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857109/
• 关键词: 自己免疫性甲状腺疾患; TSH受容体; 抗TSH受容体抗体; バセドウ病; 特発性粘液水腫; 糖鎖

本研究では、遺伝子工学的手法を用いて抗TSH受容体抗体の認識するTSH受容体の構造を解明するとともに、受容体抗体の抗体結合部位や受容体の分子の三次構造とその生物学的活性の関連より、本疾患の発症機構並びにTSH受容体の情報伝達機構の解明を試みた。1.TSH受容体分子の構造解明:TSH受容体cDNAクローンの塩基配列を決定し、想定されるアミノ酸配列並びに蛋白の高次構造を解析した。2.TSH受容体分子の発現:TSH受容体(TSHR)DNAを発現ベクター(pMAM)に組み込み(pMAM‐TSHR)、Lipofectin(DOTMA)を用い真核細胞(CHO‐K1細胞)に発現させた。3.変異TSH受容体の作製:Gapped duplex法によるSite‐directed mutagenesisにより、細胞外領域のNグリコシド型糖鎖及びS‐S結合アミノ酸残基をAsn(Asn:77,99,113,177,198,302)よりGlnへ(TSHR‐Mul‐6)、Cys(Cys:24,29,31,41,390,398,408,569)よりSerへ(TSHR‐Mu7‐9)それぞれ置換変異させた。4.変異TSH受容体のTSH結合能の測定:変異TSH受容体の発現されたCHO‐K1細胞に対するTSH及び抗TSH受容体抗体の結合能を125I標識TSH及びProtein‐Aの結合により測定した。5.変異TSH受容体の生物活性の測定:変異TSH受容体の発現細胞にTSH(1nM‐10mM)7抗TSH受容体抗体(1‐10ug/ml)を添加し、細胞内cAMP産生量を指標に刺激活性を測定した。6.TSH受容体分子と情報伝達機構の解析:変異TSH受容体とTSH並びに抗TSH受容体抗体との結合様式や生物活性の成績より、受容体の情報伝達機構及び抗受容体抗体の作用機序を解析した。現在、受容体分子の三次構造を解析するとともに真核細胞における発現系において受容体分子の糖鎖と抗TSH受容体抗体との結合様式や生物活性の関連を検討中である。

In this study, we used genetic engineering methods to understand the structure of anti-TSH receptor antibodies, the relationship between antibody binding sites of receptor antibodies, the tertiary structure of receptor molecules and biological activities, the mechanism of disease development and the mechanism of information transmission of TSH receptor. 1. Structural explanation of the TSH receptor molecule: The amino acid sequence of the TSH receptor cDNA molecule was determined, the hypothetical amino acid sequence was determined, and the higher-order structure of the protein was analyzed. 2. TSH receptor molecular development:TSH receptor (TSHR)DNA development in eukaryotes (CHO-K1 cells) using pMAM (pMAM-TSHR) and DOTMA (Lipofectin). 3. Preparation of different TSH receptors:Gapped duplex method for site-directed mutagenesis, extracellular domain of N-and S-linked glycans Asn(Asn:77,99,113,177,198,302), Gln (TSHR-Mul-6), Cys(Cys:24,29,31,41,390,398,408,569), Ser (TSHR-Mu 7 - 9) and other substitutions. 4. Determination of TSH binding capacity of different TSH receptors: Determination of binding capacity of TSH and anti-TSH receptor antibodies in CHO-K1 cells 5. Measurement of Biological Activity of Different TSH Receptors: TSH(1nM-10mM) in Cells Producing Different TSH Receptors 7. Measurement of Stimulation Activity as an Indicator of Intracellular cAMP Production by Adding Anti-TSH Receptors Antibody (1 - 10ug/ml). 6. Analysis of TSH receptor molecule and information transmission mechanism: different TSH receptor, TSH and anti-TSH receptor antibody binding mode, biological activity, receptor information transmission mechanism and anti-TSH receptor antibody action mechanism. Now, the tertiary structure of the receptor molecule has been analyzed, and the relationship between the development system of eukaryotes, the carbohydrate lock of the receptor molecule, the binding mode of anti-TSH receptor antibodies, and the biological activity has been discussed.

项目成果

吉田 正: "核内レセプターと免疫抑制作用" 実験医学. 11. 770-777 (1993)

吉田正：“核受体和免疫抑制作用”实验医学 11. 770-777 (1993)。

吉田 正: "Methotrexate投与中に関節症状は寛解したが皮下結節の新生及び増大を認めた慢性関節リウマチの1例" リウマチ. 33. 74-79 (1993)

Tadashi Yoshida：“一例类风湿性关节炎，服用甲氨蝶呤后关节症状得到改善，但观察到新的增大的皮下结节”Rheumatology 33. 74-79 (1993)。

吉田 正: "ステロイドの副作用と離脱" 治療学. 27. 583-589 (1993)

吉田正 (Tadashi Yoshida)：“类固醇副作用和戒断”《治疗学》27. 583-589 (1993)。