歯周病原菌の細胞内侵入性および増殖性に関する免疫細胞化学的手法による電顕的研究

ヒト歯周病で主要な病原菌であるP.gingivalisが,ヒトマクロファージ培養系で如何なる動態を示すかを生細胞標識蛍光色素PKH-2,DCFH-DC,BCECF-AMを用いて検討した結果以下の知見が得られた。(1)PKH-2標識菌体による経時的検討:ヒトマクロファージにPKH-2標識P.gingivalis菌体を加え培養し経時的に,抗マクロファージモノクロナール抗体Leu-M3,抗補体レセプターモノクロナ-ムCR3抗体で染色しフローサイトメトリーによる解析の結果,Leu-3M+,PKH-2+細胞率は4時間:61.2±15.5%,24時間:30.7±10.2%,96時間:68.7±11.5%であり24時間で減少し96時間では4時間と同程度認めた。この所見は培養96時間の電顕所見で細胞内に菌体の存在が確認された所見と一致する。一方,CR3+細胞率は4時間:63.5±7.0%,24時間:40.7%±12.0,96時間:24.3±10.5%でCR3の発現は減少傾向にあった。(2)培養上清中のNO産生能の検討:(1)の実験培養上清中のNOラジカル産生をGriesseの方法に従い測定した結果,P.gingivalisでは6〜12時間:検出不可,24時間:0.05±0.02muM,48時間:0.03±0.02muM,72時間0.05±0.03muM,96時間:検出不可であり,F.nucleatum(F.n)との培養系72時間:0.2muMと比較して持続的低値を示した。(3)dichlorofluoresscin-diacetate(DCFH-DA)による活性酸素産生の検討:マクロファージ内活性酸素産生能は,DCFH-DCを用いたフローサイトメトリー解析の結果,活性酸素産生細胞率はP.gingivalis刺激で60分:22.0±5.6%,90分:15.7±6%,120分:23.0±1.6%,S.epidermidis刺激で60分:25.8±2.6%,90分:23.0±6.7%,120分:25.4±2.1%.F.n刺激で60分:39.3±3.9%,90分:20.4±9.7%,120分:25.4±5.3%,A.actinomycetemcomitans(A.a)刺激で60分:25.5±1.7%,90分:10.4±3.7%,120分:10.7±1.5%であり,A.aでマクロファージ内活性酸素産生が低い傾向が示された。bis(carboxyetyl)carboxyfluorescein(BCECF-AM)による細胞内PHの検討:マクロファージ食菌後60分における細胞pHをフローサイトメトリーにて検索した結果,コントロールpH7.2出250±27(平均蛍光強度)に対しP.gingivalis:206,S.epidermidis:181,F.n:155,A.a:149とP.gingivalisでは細胞内酸性化の傾向が低い傾向が認められた。

ヒト歯周病で主要な病原菌であるP.gingivalisが,ヒトマクロファージ培養系で如何なる動態を示すかを生細胞標識蛍光色素PKH-2,DCFH-DC,BCECF-AMを用いて検討した結果以下の知見が得られた。(1)PKH-2標識菌体による経時的検討:ヒトマクロファージにPKH-2標識P.gingivalis菌体を加え培養し経時的に,抗マクロファージモノクロナール抗体Leu-M3,抗補体レセプターモノクロナ-ムCR3抗体で染色しフローサイトメトリーによる解析の結果,Leu-3M+,PKH-2+細胞率は4時間:61.2±15.5%,24時間:30.7±10.2%,96時間:68.7±11.5%であり24時間で減少し96時間では4時間と同程度認めた。この所見は培養96時間の電顕所見で細胞内に菌体の存在が確認された所見と一致する。一方,CR3+細胞率は4時間:63.5±7.0%,24時間:40.7%±12.0,96時間:24.3±10.5%でCR3の発現は減少傾向にあった。(2)培養上清中のNO産生能の検討:(1)の実験培養上清中のNOラジカル産生をGriesseの方法に従い測定した結果,P.gingivalisでは6〜12時間:検出不可,24時間:0.05±0.02muM,48時間:0.03±0.02muM,72時間0.05±0.03muM,96時間:検出不可であり,F.nucleatum(F.n)との培養系72時間:0.2muMと比較して持続的低値を示した。(3)dichlorofluoresscin-diacetate(DCFH-DA)による活性酸素産生の検討:マクロファージ内活性酸素産生能は,DCFH-DCを用いたフローサイトメトリー解析の結果,活性酸素産生細胞率はP.gingivalis刺激で60分:22.0±5.6%,90分:15.7±6%,120分:23.0±1.6%,S.epidermidis刺激で60分:25.8±2.6%,90分:23.0±6.7%,120分:25.4±2.1%.F.n刺激で60分:39.3±3.9%,90分:20.4±9.7%,120分:25.4±5.3%,A.actinomycetemcomitans(A.a)刺激で60分:25.5±1.7%,90分:10.4±3.7%,120分:10.7±1.5%であり,A.aでマクロファージ内活性酸素産生が低い傾向が示された。bis(carboxyetyl)carboxyfluorescein(BCECF-AM)による細胞内PHの検討:マクロファージ食菌後60分における細胞pHをフローサイトメトリーにて検索した結果,コントロールpH7.2出250±27(平均蛍光強度)に対しP.gingivalis:206,S.epidermidis:181,F.n:155,A.a:149とP.gingivalisでは細胞内酸性化の傾向が低い傾向が認められた。