歯周病原菌の細胞内侵入性および増殖性に関する免疫細胞化学的手法による電顕的研究

免疫细胞化学技术对牙周病原菌细胞内侵袭和增殖的电镜研究

• 批准号: 05857201
• 负责人: 葛城 :啓彰
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: The Nippon Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857201/
• 关键词: マクロファージ; P.gingivalis; PKH-2; DCFH-DA; BCECF-AM

ヒト歯周病で主要な病原菌であるP.gingivalisが,ヒトマクロファージ培養系で如何なる動態を示すかを生細胞標識蛍光色素PKH-2,DCFH-DC,BCECF-AMを用いて検討した結果以下の知見が得られた。(1)PKH-2標識菌体による経時的検討:ヒトマクロファージにPKH-2標識P.gingivalis菌体を加え培養し経時的に,抗マクロファージモノクロナール抗体Leu-M3,抗補体レセプターモノクロナ-ムCR3抗体で染色しフローサイトメトリーによる解析の結果,Leu-3M+,PKH-2+細胞率は4時間:61.2±15.5%,24時間:30.7±10.2%,96時間:68.7±11.5%であり24時間で減少し96時間では4時間と同程度認めた。この所見は培養96時間の電顕所見で細胞内に菌体の存在が確認された所見と一致する。一方,CR3+細胞率は4時間:63.5±7.0%,24時間:40.7%±12.0,96時間:24.3±10.5%でCR3の発現は減少傾向にあった。(2)培養上清中のNO産生能の検討:(1)の実験培養上清中のNOラジカル産生をGriesseの方法に従い測定した結果,P.gingivalisでは6〜12時間:検出不可,24時間:0.05±0.02muM,48時間:0.03±0.02muM,72時間0.05±0.03muM,96時間:検出不可であり,F.nucleatum(F.n)との培養系72時間:0.2muMと比較して持続的低値を示した。(3)dichlorofluoresscin-diacetate(DCFH-DA)による活性酸素産生の検討:マクロファージ内活性酸素産生能は,DCFH-DCを用いたフローサイトメトリー解析の結果,活性酸素産生細胞率はP.gingivalis刺激で60分:22.0±5.6%,90分:15.7±6%,120分:23.0±1.6%,S.epidermidis刺激で60分:25.8±2.6%,90分:23.0±6.7%,120分:25.4±2.1%.F.n刺激で60分:39.3±3.9%,90分:20.4±9.7%,120分:25.4±5.3%,A.actinomycetemcomitans(A.a)刺激で60分:25.5±1.7%,90分:10.4±3.7%,120分:10.7±1.5%であり,A.aでマクロファージ内活性酸素産生が低い傾向が示された。bis(carboxyetyl)carboxyfluorescein(BCECF-AM)による細胞内PHの検討:マクロファージ食菌後60分における細胞pHをフローサイトメトリーにて検索した結果,コントロールpH7.2出250±27(平均蛍光強度)に対しP.gingivalis:206,S.epidermidis:181,F.n:155,A.a:149とP.gingivalisでは細胞内酸性化の傾向が低い傾向が認められた。

で ヒ ト 歯 weeks disease basically な pathogen で あ る P.g ingivalis が, ヒ ト マ ク ロ フ ァ ー ジ training department how で な る dynamic を shown す か を raw cell identification 蛍 photopigment PKH - 2, DCFH - DC, BCECF - AM を with い て beg し 検 た results ら の know of these が れ た. PKH - 2 (1) identify bacteria に よ る 経 検 please: when ヒ ト マ ク ロ フ ァ ー ジ に PKH - 2 logo P.g ingivalis bacteria を plus え cultivate し 経 に, anti マ ク ロ フ ァ ー ジ モ ノ ク ロ ナ ー ル antibody Leu - M3, resistance to complement レ セ プ タ ー モ ノ ク ロ ナ - ム で CR3, antibody staining し フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ る parsing の results, Leu - 3 m +, PKH は 4-2 + cells rate time: 61.2 + / - 15.5%, 24 time: 30.7 + / - 10.2%, 96 time: 68.7 + / - 11.5% で あ り 24 time reduce で し 96 で は 4 time と with degree to recognize め た. The <s:1> <s:1> was observed after 96 hours of <s:1> culture. The <s:1> electrolysis 顕 showed the presence of に bacteria in the で cells. The が confirmed that the された were consistent with the と. Side, CR3, rate of + cells は 4 time: 63.5 + / - 7.0%, 24 time: 40.7% + / - 12.0, 96 time: 24.3 + / - 10.5% で CR3, の 発 は now reduce tendency に あ っ た. (2) The production of <s:1> NO in the culture supernatant can be achieved through <s:1> 検 :(1) <s:1> experimental culture supernatant of <s:1> NOラジカ に従 production をGriesse <s:1> method に従 検 determination of <s:1> た results,P.gingivalisで ラジカ 6-12 time :検 cannot be obtained,24 time :0.05±0.02muM,48 time :0.03±0.02muM , 0.05 + / - 0.03 muM 72 time, 96 time: 検 out not で あ り, motor ucleatum co) と の cultivate 72 time: 0.2 muM と compare し て hold 続 low numerical を shown し た. (3) dichlorofluoresscin - diacetate (DCFH - DA) に よ る acid active element produces の beg: 検 マ ク ロ フ ァ ー ジ within active acid can produce は, DCFH - DC を with い た フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー parsing の as a result, the activity of acid element produced cell rate は P.g ingivalis Stimulate で 60 points: 22.0 + / - 5.6%, 90 points: 15.7 + / - 6%, 120 points: 23.0 + / - 1.6%, S.e pidermidis stimulus で 60 points: 25.8 + / - 2.6%, 90 points: 23.0 + / - 6.7%, 120 points: 25.4 + / - 2.1%. The motor stimulation で 60 points: 39.3 + / - 3. 9%, 90:20.4 + / - 9.7%, to 120 points: 25.4 + / - 5.3%, A.a ctinomycetemcomitans (A.a) stimulation で 60 points: 25.5 + / - 1.7%, 90 points: 10.4 + / - 3.7%, 120 points: 10.7 + / - 1.5% で あ り, A.a で マ ク ロ フ ァ ー ジ The production of endoactive acids has a が low が tendency が indicating された. Bis (carboxyetyl) carboxyfluorescein (BCECF - AM) に よ る intracellular PH の beg: 検 マ ク ロ フ ァ ー ジ food bacteria after 60 minutes に お け る cell PH を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て 検 cable し た results, コ ン ト ロ ー ル pH7.2 out 250-27 (average 蛍 light Intensity) に し seaborne P.g ingivalis: 206, S.e pidermidis: 181, motor 155, A.a: 149 と P.g ingivalis で は acidic in cells tended to の が low い が recognize め ら れ た.