膜結合型及び分泌型Steel FactorによるC-KIT活性化の生物学的検討

膜结合和分泌型 Steel Factor 激活 C-KIT 的生物学研究

• 批准号: 06770857
• 负责人: 宮沢 啓介
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770857/
• 关键词: c-kit; Steel factor; receptor; tyrosine kinase; phoshporylation; stromal cell

平成6年度の研究計画は概ね実施され,その結果は1995年のBloodに論題“Membrane-bound Steel factor induces more persistent tyrosine kinase activation and longer life span of c-kit gene-encoded protein than its soluble form"として発表された。その内容は以下の通りである。Sl/Sl homozygoteより樹立したfibroblastic cell lineに,alternative splicingされた各ヒトSteel factor cDNAを遺伝子導入し,膜結合型(Sl4-h220)及び分泌型(Sl4-h248)Steel factor(SLF)のみを選択的に産生するstromal cell lineを作成した。このstromal cellをSLF各isoformのsourceとして用いて,factor-dependent cell lineであるMO7e細胞と共培養を行い,経時的に細胞内蛋白を可溶化。anti-phosphotyrosineモノクローナル抗体を用いたimmunoblottingによりMO7e細胞内蛋白のtyrosine phosphorylation,c-kit蛋白(KIT)の活性化のkineticsについて検討を行った。膜結合型SLFは分泌型SLFに比べて長時間にわたりKITの活性化を誘導し,かつ,リガンド結合後のKIT蛋白の半減期が著明に延長された。この膜結合型SLFの系にrecombinant soluble SLFを添加することにより,KITのキナーゼ活性の不活化が迅速となり,かつ,KIT蛋白の半減期は著明に短縮した。Flowcytometryでは,分泌型SLF刺激後ではKIT-リガンド複合体のinternalizationによりMO7e細胞表面のKIT発現量は急激は低下したのに対して,膜結合型SLF刺激ではKITのdown modulationは誘導されなかった。このように,膜結合型および分泌型SLFではKITの活性化のkinetics,半減期が大きく異なることが明らかとなり,この差は両SLF isoformの生物活性の差として反映されることが示唆された。また,ligand-receptor複合体の細胞内へのinternalizationおよびそれに続く分解は,活性化されたKITのスウイッチをオフにする機構としても作用していると考えられる。

The research project of Heisei 6 was carried out, and the results were reversed from the 1995 Blood topic "Membrane-bound Steel factor induces more persistent tyrosine kinase activation and longer life span of c-kit gene-encoded protein than its solution form." The content of Sl/Sl homozygote is used to establish fibroblastic cell lines,alternative splicing is used to introduce each Steel factor cDNA, and membrane bound (Sl4-h220) and secretory (Sl4-h248)Steel factor(SLF) are used to create stromal cell lines. The stromal cell, SLF isoform, and factor-dependent cell line were co-cultured and solubilized. Anti-phosphotyrosine antibodies are used in immunoblotting to detect tyrosine phosphorylation of MO7e intracellular proteins, and the kinetics of activation of c-kit protein (KIT) is discussed. The activation of KIT was induced in membrane-bound SLF for a longer time than in secretory SLF, and the half-life of KIT protein after binding was significantly prolonged. This membrane-bound SLF system is recombinant solution SLF. When SLF is added,KIT protein activity is rapidly inactivated. When SLF is added,KIT protein half-life is shortened. Flowcytometry showed that KIT-free complex internalization was induced by secretory SLF stimulation, and KIT production on MO7e cell surface decreased rapidly, whereas membrane-bound SLF stimulation induced KIT down modulation. The membrane bound SLF and the secretory SLF have the kinetics of KIT activation, and the half-life of the SLF isoform is different from that of KIT isoform. The intracellular internalization of the ligand-receptor complex and its mechanism for activation of KIT are discussed.

项目成果

Gotoh A,Miyazawa K. et al.: "Tyrosine phosphorylation and activation of focal adhesion kinase (p125^<FAK>)by BCR-ABL oncoprotein." Experimental Hematology. (in press). (1995)

Gotoh A、Miyazawa K. 等人：“BCR-ABL 癌蛋白对酪氨酸磷酸化和粘着斑激酶 (p125^<FAK>) 的激活。”

Miyazawa K. et al.: "Membrane-bound Steel factor induces more peristent tyrosine Kinase activation and longer life span of c-kit gene-encoded protein than its soluble form." Blood. 85. 641-649 (1995)

Miyazawa K. 等人：“与可溶形式相比，膜结合 Steel 因子可诱导更持久的酪氨酸激酶激活，并延长 c-kit 基因编码蛋白的寿命。”

Miyazawa K. et al.: "Ligand-dependant polyubiquitination of c-kit gene product:a possible mechanism of receptor down modulation in MO7e cells." Blood. 83. 137-145 (1994)

Miyazawa K. 等人：“c-kit 基因产物的配体依赖性多泛素化：MO7e 细胞中受体下调的可能机制。”

宮澤 啓介,外山 圭助: "慢性骨髄性白血病におけるBCR/ABLのシグナル伝達" 日本内科学会雑誌. (印刷中). (1995)

Keisuke Miyazawa、Keisuke Toyama：“慢性粒细胞白血病中的 BCR/ABL 信号转导”，日本内科学会杂志（1995 年出版）。