歯内組織中のサイトカイン微量検出法の確立

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歯周病は部位特異的に活動期と非活動期(休止期)を繰り返しながら進行していく炎症疾患であると言われており、その病態を性格に把握する事は疾病活動度に応じた治療方針を立案する上で非常に重要である。今回微量検体からの検出が可能である。reverse transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)法を応用して種々のサイトカインmRNAを増幅し、更に半定量的にRT-PCR系を確立し多面的な解析を計画した。炎症状態に関与していると考えられるサイトカインからIL-1α・β,IL-8,IL-6,TNF-αを指標としてRT-PCR法によるmRNA検出を試みた。市販の各種PCRプライマーを購入し指示書に示された方法により付属のテンプレートから予測される増幅産物がDNA染色により検出された。更に種々のヒト腫瘍細胞からRNAzolを用いて抽出されたRNAからcomplimentary DNA(cDNA)を合成し、鋳型として用いたところコントロールと同様の増幅産物が検出された。そこで半定量的RT-PCR法を確立するために、RNA抽出に用いる検体量、cDNA合成に用いるRNA量或いは増幅回数を変化させ至適条件を検討したところ、一定のRNA量から合成したcDNAを用いて異なる増幅回数で産物を回収する事で飽和に至らない半定量的条件を設定できた。本法を歯周外科手術時に得られた歯肉片に応用したところ歯肉片から抽出されたRNAにも応用できることが判明した。現在多数の検体を用いた解析と同時に更に少量の検体から半定量的検出及び特異的オリゴヌクレオチドを用いたプロービングによる検出感度の上昇をはかり本法の応用範囲の拡大を計画している。今後、炎症状態の重篤度と検出されるサイトカインmRNA量との関連を検討していく予定である。