血管内皮細胞由来の誘導性一酸化窒素合成酵素(NOS)の反応機構と制御機構の解明

阐明血管内皮细胞诱导型一氧化氮合酶（NOS）的反应和控制机制

• 批准号: 06772162
• 负责人: 小森 由美子
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Meijo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772162/
• 关键词: 一酸化窒素合成酵素; NOS; 血管内皮細胞; NADPH

1.ウシ大動脈より剥離、培養した内皮細胞を継代培養し、可溶性画分と膜画分のconstitutiveなNOS活性を測定したところ、活性の約80%が膜画分に存在していたため、さらに酵素の可溶化条件を検討した。各種界面活性剤のうち、Zwittergentを用いたとき最も効率よく可溶化を行うことができた。2.血管内皮細胞の大量培養条件を検討するため、Cytodex3、Biosilon、Collagen spongeを用いてスピナ-ボトル中で細胞を培養した後、コラ-ゲナーゼによる細胞の回収を試みた。その結果collagen spongeが最も効率よく多量の細胞を得るのに適していた。3.誘導性NOS(iNOS)の性質を比較するため、ラット肺胞マクロファージ(Mφ)を培養し、酵素の誘導条件をLPS、IFN-γを用いて検討した後、ADP-Sepharose、ResourceQカラムによりiNOSの精製を行った。精製したiNOSについてその反応生成物の検討を行ったところ、反応系に添加した基質アルギニンが全て消費された後にも反応液中のNADPH量は引き続き減少し、アルギニン未添加の系で報告されている過酸化水素、あるいはスーパーオキシドの生成(ESR法による)が観察された。この結果は従来報告されているNOSによる反応生成物シトルリンとNADPH消費の比率(1:1.5)が反応時間にともなって変化する可能性を示唆しており、現在提唱されているNOSの反応機構については検討を加える必要があると考えられた。本年度の研究では内皮細胞由来のiNOSの反応機構を検討するまでに到らなかったが、Mφ由来のiNOSで上に述べた重要な知見が得られたため、今後は内皮細胞由来のiNOSについても反応機構を解明し、また未だにその役割が明らかでないコファクターBH_4についても検討を加えてゆきたい。

1. Exfoliation and culture of aorta, endothelial cells, generation culture, and soluble endothelial cells and membrane cells are constitutive. The OS activity is determined by measuring the presence of approximately 80% of the activity in the film, and the solubilization conditions of the enzyme are determined. Various interface active agents and Zwittergent are the most efficient and effective solubilizers. 2. Mass culture conditions of vascular endothelial cells: Cytodex3, Biosilon, Collagen After the sponge was cultured with いてスピナ-ボトル中でcells, the コラ-ゲナーゼによるcells were recovered and tested. As a result, the collagen sponge is the most efficient and the large number of cells is the most suitable. 3. Comparison of the properties of inducible NOS (iNOS), culture of ラットママクロファージ(Mφ), and enzyme induction conditions of LPS , IFN-γを用いて検问した后, ADP-Sepharose, ResourceQカラムによりiNOSの精品を行った. Refined したiNOSについてそのreaction product の検question を行ったところ、reaction NADP is added to the matrix and is used as a base for consuming it and then reacting in the solution. The amount of H is reduced, the report of the system without added H content, and the overacidified water Elements, あるいはスーパーオキシドの generate (ESR method による) が観看された.このResults are reported hereされているNOSによるReaction productsシトルリンとNADPH consumption ratio (1:1.5)がReaction timeにともなって変化するpossibilityをshows instigationしており、Now mentions されているNO The Sのreaction mechanism is necessary and necessary. This year's research focuses on the origin of endothelial cells and the reaction mechanism of iNOS.なかったが、MφoriginのiNOSで上に说べたimportantなknowledgeがgetられたため、Now Origin of endothelial cells丶明が明らかでないコファクターBH_4についても検褜を加えてゆきたい.