筋小胞体カルシウムポンプの活性に関与チロシン残基の修飾と同定

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筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの反応にチロシン残基が関与しているか否か検討するため、テトラニトロメタン(TNM)を用いてチロシン残基を修飾し、その影響を調べた。1)TNMによるSH基の修飾を抑さえるため、テトラチオネートによるSH基の保護を試みたところ、4mMテトラチオネート2時間処理によりCa-ATPase活性は完全に抑えられ、4mM DTT 3時間処理により最大40%の活性の回復が見られた。2)テトラチオネート処理してSH基を保護した筋小胞体膜(SRV)1mg/mlを、0.1M KCl.50mM Tris-HCl(pH8.0).1mMCaCl_2存在下100μM TNMで処理した後、DTT処理により保護基をはずしてCa^<2+>-ATPase活性を測定した。活性はTNM処理時間の増加とともに低下し、10分で50%、60分で20%以下となった、16mM MgATPはこの阻害に対して保護効果を示さなかった。TNMによる活性阻害はpHに依存した。pH7.0では、TNMはなお十分な阻害を示したが、pH6.0では阻害は著しく遅くなった。3)TNMはSH基も修復するが、テトラチオネート処理後に残存するSH基がTNMによって修飾される速度は、pH8.0と6.0でほとんど異ならなかった。以上の結果は、TNMによる阻害がチロシン残基の修飾によって起こることを示唆している。4)TNM処理したSRVよりCa^<2+>-ATPaseをゲルろ過HPLCにより精製し、TNMによってニトロ化されたチロシンを分光学的に定量した。ニトロ化は60分までは速やかに進み12nmol/mgのニトロチロシンを生じた。その後ニトロ化の速度は著しく遅くなった。この結果は、Ca^<2+>-ATPase1モル当たり1から2モルのチロシン残基のニトロ化が強い活性阻害を起こすことを示唆している。