FDNP-ヌクレオチドによる筋小胞体カルシウムポンプのATP結合部位の解析

使用 FDNP 核苷酸分析肌浆网钙泵的 ATP 结合位点

• 批准号: 05780470
• 负责人: 山崎 和生
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780470/
• 关键词: FDNP-ATP; カルシウムポンプ; 筋小胞体; ATP結合部位

ATPのアナログであるFDNP-ATPを合成し、これを用いて筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseを親和修飾する事により、以下の結果を得た。1.家兎骨格筋より調製した筋小胞体をMg^<2+>存在下、pH7.0、25℃で40muM FDNP-ATPとインキュベートすると、Ca^<2+>-ATPase活性は時間とともに低下し、4時間で20%以下になった。この活性阻害は20mM MgATPにより完全に保護された。2.FDNP-ATPの筋小胞体膜への取り込みも時間と共に増加し、20mM MgATPはその一部を抑えた。FDNP-ATP取り込み量のうち、MgATPで抑制される部分とCa^<2+>-ATPase活性の間には直線関係が認められた。この直線の外挿値から3.6nmol/mgのMgATP感受性FDNP-ATP結合によりCa^<2+>-ATPase活性が完全に抑えられることが示唆された。3.FDNP-ATP処理によりCa^<2+>-ATPase活性と同様に、ATPからのEP形成及びアセチルリン酸分解活性は阻害されたが、リン酸からのEP形成は全く阻害されなかった。またアセチルリン酸はMgATPと同様、FDNP-ATPによる酵素の阻害に対して保護効果を示したが、リン酸は全く保護効果を示さなかった。4.FDNP-ATP処理した筋小胞体よりCa^<2+>-ATPaseを精製し、トリプシン消化を行ったところ、FDNP-ATPの結合したペプチドが4本得られた。これらのペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、いずれもCa^<2+>-ATPaseの492番目のリジン残基にのみFDNP-ATPが結合していた。これらの結果より、FDNP-ATPはCa^<2+>-ATPaseのATP結合部位に結合して酵素の阻害を引き起こすことが示され、Ca^<2+>-ATPaseの492番目のリジン残基はATP結合部位のalpha-リン酸基近傍で、3′-OH基側に位置することが示唆された。

Synthetic synthesis of ATP using FDNP-ATP, and affinity modification of ATPase with Ca^<2+>-ATPase, and the following results were obtained. 1. In the presence of Mg^<2+> prepared by Jiawugu gridded ribs, it is 40muM at pH 7.0 and 25°C. The activity of FDNP-ATP is low, the Ca^<2+>-ATPase activity is low, and the activity of Ca^<2+>-ATPase is lower than 20% at 4 hours. The active blocking of 20mM MgATP is completely protective. 2. Add FDNP-ATP to the small cell body membrane and add 20mM MgATP. There is a linear relationship between the amount of FDNP-ATP and the inhibitory part of MgATP and the Ca^<2+>-ATPase activity. The extrapolation value of the straight line is 3.6 nmol/mg. The sensitivity of MgATP to FDNP-ATP binding and the activity of Ca^<2+>-ATPase are completely suppressed. 3. FDNP-ATP treatment and Ca^<2+>-ATPase activity and ATP treatment The formation and decomposition activity of びアセチルリン acid hinders the formation of されたが, and the formation of リン acid からのEP does not hinder the formation of されなかった. MgATP and FDNP-ATP enzyme The protection effect of blocking is good, and the protective effect of リン acid is full is good. 4. FDNP-ATP treatment, muscle cell body, Ca^<2+>-ATPase, purification,トリプシン digestive を行ったところ, FDNP-ATP のcombination したペプチドが4 本得られた.これらのペプチドのアミノacid sequence をdeterminationしたところ、いずれもCa^<2+>- ATPase No. 492 No. のリジン residue FDNP-ATP binding していた.これらのRESULT より、FDNP-ATPはCa^<2+>-ATPaseのATP binding site にbinding してenzyme のblocking をinducing こすことが Show され、Ca^ <2+>-ATPase's 492-page のリジン residue is adjacent to the alpha-リン acid group of the ATP binding site and is adjacent to the 3'-OH group side.