カルボキシルトランスフェラーゼのアセチル-CoA結合部位の構造解析

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大腸菌アセチル-CoAカルボキシラーゼのサブユニットのうちの一つであるカルボキシルトランスフェラーゼ(CT)のアセチル-CoA結合部位の構造を解析する目的でピリドキサールリン酸誘導体を中心にして,化学修飾実験を行った.検索を行った試薬のうち,ピリドキサールリン酸(PLP)及びビスピリドキサールリン酸(bis(PLP))によりCTは効果的に化学修飾され,その酵素活性が消失することがわかった.特に反応できる活性なアルデヒド基を二つ有するbis(PLP)を用いた化学修飾実験ではCTの二つのサブユニットであるα及びβサブユニットの架橋反応が観察された.この架橋反応は失活反応とほぼ一対一で対応していた.また基質であるアセチル-CoAの共存下,PLPあるいはbis(PLP)による修飾反応を行ったところ,その失活反応が抑制されたことにより,これら両試薬はCTのアセチル-CoA結合部位に結合することにより,その失活を引き起こすと考えられた.またbis(PLP)を用いた架橋反応に及ぼすアセチル-CoAの効果について検討したところ,アセチル-CoAの存在によりCTのα及びβサブユニットのbis(PLP)による架橋反応は顕著に抑制されることが分かった.この結果よりCTのアセチル-CoA結合部位はCTのα及びβサブユニットのサブユニット間領域に存在することが明らかとなった.これら両化合物の反応性から,CTのアセチル-CoA結合部位には活性に必須のリジン残基が存在することが明らかとなった.またbis(PLP)より架橋反応が起こることから,そのリジン残基に近接してもう一つ別のリジン残基が存在することが分かった.