神経成長抑制因子GIFの受容体の同定とクローニング

神经生长抑制因子受体的鉴定和克隆 GIF

基本信息

  • 批准号:
    06780519
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.58万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1994
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1994 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究では、神経成長抑制因子GIFの受容体を同定し、クローニングすることを目的とした。私たちは、GIF受容体をExpression Cloning法でクローニングすることを計画し、このプロジェクトをスタートした。なぜなら、このクローニング方法ではGIF受容体タンパク質の情報を必要としないからである。必要になってくるのはリガンドGIFの大量供給のシステムを確立することである。68個のアミノ酸からなり、システインに富むGIFを化学合成することは不可能である。他の選択は、組み換え体を利用することである。一般に用いられている大腸菌による生産では、構造上、活性の高いタンパク質は得にくい。実際、大腸菌で生産したGIFは天然のもと比較すると、その活性は一桁落ちる。そこで残された選択は、バキュロウイルス発現システムの利用である。本年度は、受容体研究に欠かせない良質のリガンドGIFを大量に供給するためのバキュロウイルス発現システムの確立に終始した。具体的には次のとおりである。1.バキュロウイルス発現系によるヒト組み換え体GIFタンパク質の発現と精製ヒトGIFcDNAをtransfer vectorpBKblueに組み込み、発現ベクターを構築した。発現後の精製を容易にするために3'末側に6個ヒスチジンをPCR法を用いて導入した。この発現ベクターをリン酸カルシウム法を用い蚕核多角病ウイルスDNAとともに昆虫細胞BmN4に導入した。この過程でGIFを組み込んだ発現ベクターはホモロガスリコンビネーションによりウイルスDNAに組み込まれることが期待される。用いたtransfer vectorが1acZ遺伝子を持つことを利用し、組み換え体ウイルスを精製した。感染操作を繰り返し、ウイルスのタイタ-を十分あげた。BmN4細胞での発現は、RT-PCR法により確認された。また、現在発現システムの系を拡大し、ニッケルカラムを用いてGIFタンパク質を精製している最中である。以上の研究成果はBiochem.Biophys.Res.Commun.誌に投稿予定である。
The objective of this study is で た, the receptor of the inhibitory factor of Shinto growth GIF を is the same as that of <s:1>, ロ, ニ, ニ, グする, とを, とを and とを. Private た ち は, GIF, let body を Expression Cloning method で ク ロ ー ニ ン グ す る こ と を plan し, こ の プ ロ ジ ェ ク ト を ス タ ー ト し た. な ぜ な ら, こ の ク ロ ー ニ ン グ method で は GIF by let body タ ン パ ク qualitative の intelligence を necessary と し な い か ら で あ る. It is necessary to provide a large quantity of になってくる <s:1> リガ リガ ド ドGIF システムを to establish する とである とである. 68 の ア ミ ノ acid か ら な り, シ ス テ イ ン に rich む GIF を chemical synthesis す る こ と は impossible で あ る. He should choose 択, form み and switch to え, を and utilize する する とである とである. Generally, に uses に られて <s:1> る る escherichia coli による to produce で にく, structurally and with <s:1> high activity <s:1> タ <s:1> パ パ パ <s:1> quality <e:1> にく にく. In fact, the で production of escherichia coli で たGIF <s:1> natural <s:1> と と と comparison of すると and そ <s:1> activity ちる is the same ちる. Youdaoplaceholder0 ス で select された, バキュロウ バキュロウ ス ス ス ス occur システム である utilize である. は this year, the research に owe か せ な い good quality の リ ガ ン ド GIF を supply a large number of に す る た め の バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 発 now シ ス テ ム の establish に beginning し た. The specific に に subtimes are とお である である. 1. バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 発 now is に よ る ヒ み ト group in え body GIF タ ン パ ク qualitative の 発 now と refined ヒ ト GIFcDNA を transfer vectorpBKblue に group み 込 み, 発 now ベ ク タ ー を build し た. After the occurrence, the を refinement is easy to にするために3' end に6 ヒスチジ <s:1> をPCR method を is introduced into the た た by を て. こ の 発 now ベ ク タ ー を リ ン acid カ ル シ ウ ム method with い silkworm nuclear many を disease ウ イ ル ス DNA と と も に insect cell BmN4 に import し た. こ の process で GIF を group み 込 ん だ 発 now ベ ク タ ー は ホ モ ロ ガ ス リ コ ン ビ ネ ー シ ョ ン に よ り ウ イ ル ス DNA に group み 込 ま れ る こ と が expect さ れ る. Use い た transfer vector が 1 acz heritage 伝 son を hold つ こ と を using し, group change み え ウ イ ル ス を refined し た. The infection operation を to return to あげた, ウ ウ ス ス ス <s:1> タ タ タ-を is very あげた. The occurrence of で in BmN4 cells is, and the confirmation of された by RT-PCR is によ によ. ま た, now 発 now シ ス テ ム の is を company, big し, ニ ッ ケ ル カ ラ ム を with い て GIF タ ン パ ク qualitative を refined し て い る in most で あ る. Research achievements above の は Biochem.Biophys.Res.Com mun. The publication に is submitted to である.

项目成果

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