スタフィロコッカルヌクレアーゼの変異体の作成と折れたたみ機構の解析

突变型葡萄球菌核酸酶的构建及折叠机制分析

• 批准号: 06780525
• 负责人: 伊倉 貞吉
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780525/
• 关键词: スタフィロコッカルヌクレアーゼ; 変異体; T7プロモーター; M13 ori; 巻き戻り反応; ストップトフロー法; シャペロニン

スタフィロコッカルヌクレアーゼ(SNase)の変異体を容易に作成し、さらに大量に獲得できるような大腸菌での発現系を確立した。具体的には、T7プロモーターを有し、ヘルパーファージM13KO7により容易に一本鎖の調製ができる多コピー数プラスミドpMT7を構築し、それにSNaseの遺伝子を導入した(pMT7-SN)。pMT7は、熊谷博士(東大・工)からいただいたプラスミドpUT7(pUC19にpET15bのT7プロモーター領域を導入したもの)に、pUC118のM13oriとマルチクローニング部位とをAatIIとBamHI部位で二重消化後ライゲーションによって導入したものである。pMT7へのSNase遺伝子の導入は、PCR法を用いたSNase遺伝子領域の増幅と5'側にNcoI部位の作成後に、pMT7のNcoI部位とSalI部位の間に挿入することによって行った。pMT7-SNで形質転換した大腸菌BL21(DE3)/pLysSは、IPTGによるインダクション後4時間で大量のSNaseを発現することがSDS-PAGEにより確認された。さらに、このSNaseはInclusion Bodyとしてではなく、活性をもつ状態のまま菌体中に存在することを、SDS-PAGEと活性測定により確かめた。活性から見積られたSNaseの発現量は、1lの大腸菌の培養液あたり約140mgであった。この値は、これまでのlac-tacタンデムプロモーターを用いた系に比べて10倍以上、また、pLプロモーターを用いた系に比べて約2〜3倍にあたる。SNaseの精製は、2回の塩析とゲル濾過及びイオン交換カラムとにより行った。この系により新たに4種類のSNaseのプロリン変異体(P47A,P47T,P56A,P117G)が獲得された。現在、各変異体の巻き戻り反応を各種ストップトフロー法により調べているところである。今後、さらにシャペロニンGroELとの相互作用も調べる予定である。

ス タ フ ィ ロ コ ッ カ ル ヌ ク レ ア ー ゼ (SNase) の - variant を に easily make し, さ ら に large に get で き る よ う な coliform で の を 発 now department establish し た. Specific に は, T7 has プ ロ モ ー タ ー を し, ヘ ル パ ー フ ァ ー ジ M13KO7 に よ り easy に a lock の modulation が で き る more コ ピ ー number プ ラ ス ミ ド pMT7 を constructing し, そ れ に SNase の heritage 伝 son を import し た (pMT7 - SN). Dr PMT7 は, bear valley (university) か ら い た だ い た プ ラ ス ミ ド pUT7 (pUC19 に pET15b の T7 has プ ロ モ ー タ ー field を import し た も の) に, pUC118 の M13ori と マ ル チ ク ロ ー ニ ン グ parts と を AatII と BamHI site で double digestion after ラ イ ゲ ー シ ョ ン に Youdaoplaceholder0 import the た た である である である である. PMT7 へ の SNase heritage を 伝 の import は, PCR method with い た SNase heritage 伝 sub-fields of の raised と 5 'side に NcoI site の is made after に, pMT7 の NcoI site と SalI parts between の に scions into す る こ と に よ っ て line っ た. PMT7 - SN で form quality planning in し た coliform BL21 (DE3)/pLysS は, IPTG に よ る イ ン ダ ク シ ョ ン で 4 time after a large number of の SNase を 発 now す る こ と が sds-page に よ り confirm さ れ た. さ ら に, こ の SNase は Inclusion Body と し て で は な く, active を も つ state の ま に ま strain exist す る こ と を, sds-page と activity determination に よ り か indeed め た. The active ら ら volume られたSNase <s:1> occurrence amount, 1l of <s:1> escherichia coli <s:1> culture medium あた <e:1> approximately 140mgであった. こ の numerical は, こ れ ま で の lac - tac タ ン デ ム プ ロ モ ー タ ー を with い た department に than べ て over 10 times, ま た, pL プ ロ モ ー タ ー を with い た department に than べ て about 2 ~ 3 times に あ た る. SNase <s:1> refining, two-stage <s:1> salt precipitation とゲ <s:1> filtration and び, <s:1>, and <s:1> exchange カラムとによ カラムとによ and った. こ の is に よ り new た に 4 kinds の SNase の プ ロ リ ン - variants (P47A P47T, P56A, P117G) が get さ れ た. Now, for each variant, the scroll 戻 戻 is used to reverse 応を various ストップトフロ ストップトフロ methods によ ろである to adjust べて ると ると ると ろである ろである. In the future, the さらにシャペロニ と GroELと と interaction べる is determined by べる である.