相同組換え開始機構の再構成系を用いた解析

点击翻译按钮获取中文摘要

出芽酵母の減数分裂時における相同組換えの大部分は、染色体の特定の部位(ホットスポット)に生じるDNA二重鎖の切断によって開始される。我々は前年度までに、出芽酵母相同組換えのホットスポットで、二重鎖切断に先行してクロマチン構造の局所的な構造変化が起こることを見出した[EMBOJ.,13,p 5754-5763(1994)]。今回、このクロマチン構造変化の相同組換え開始機構における意義を調べる目的で、出芽酵母組換え欠損株数種(mre2,m rell,rad50,rad50S)のホットスポット上のクロマチン構造の変化について解析を行った。これらの株は相同組換えホットスポット(頻発部位)上のDNA二重鎖の切断に欠損を示す。実験としては、減数分裂期にある各種変異株からクロマチン画分を単離し、球菌ヌクレアーゼで部分消化を行った。続いて、減数分裂期のホットスポットであるARG4及びCYS3遺伝子座のプローブによる間接末端標識法を行った。その結果、1)いずれの変異株においても超感受性部位の位置については有糸・減数分裂を通じて同一で、野生型における位置と変わらなかった。2)rad50の遺伝子破壊株およびrad50sでは、野生型に匹敵するMNaseに対する感受性の増大が減数分裂初期に認められた。3)mre2とmer11では感受性の増大が著しく低下していた。以上から、ホットスポット上でのクロマチン構造変化が組換え開始の制御に密接な関連を持つものであることが明らかになった。また、クロマチン構造の変化については、MRE2及びMRE11によって間接あるいは直接的に制御されている可能性がある事が示唆された。クロマチン構造変化を試験管内で誘起する系の開発については、プライマー伸長法を利用したクロマチン構造変化の検出系を構築し、MRE11、RAD50遺伝子をクローニングした。