グルタミン酸脱水素酵素アイソザイムの分離精製とcDNAライブラリーの作成

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ナタネの葉を切り刻み25Cで一晩放置し、GDH7を誘導させた。この操作によって葉の老化が進行しアンモニアが生成してGDH7は特異的に誘導された。GDHの分離精製は35%硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、調整用電気泳動の順に行った。その結果、精製倍率は400倍となりSDS-PAGEを行ったところ1本のバンドとして確認された。GDH1及びGDH7の基質に対するKm値を比較検討した結果、両者に著しい差異は認められなかった。PAS染色したところ発色が確認されたことより糖タンパク質であることが示唆された。現在、GDH1及び7の抗体を作成するために大量に精製中である。GDH1及び7はそれぞれα、βサブユニットから構成されており、二次元電気泳動によって両者を分離し、免疫学的性質を比較し、ウェスタンブロット法で両者の発現調節機構の解明を計画中である。GDH1及び7アイソザイムの酵素化学的性質に著しい差異は認められなかったことから、両者の遺伝子をクローニングして遺伝子レベルでの発現調節機構を解明するために、葉肉プロトプラストからmRNAを単離し、cDNAのクローニングを試みた。λシャロンベクターを用いEcoRI,NotIの接着末端からディレクショナルクローニングを試みた。しかしながら、遺伝子のクローニングは初心者のため実験系のセッティングに手間取りライブラリーの作成までに留まった。今後、イネの3′末端を含むcDNAをプローブとしてナタネのGDH遺伝子をスクリーニングすることを計画中である。