グルタミン酸脱水素酵素アイソザイムの分離精製とcDNAライブラリーの作成

谷氨酸脱氢酶同工酶的分离纯化及cDNA文库的建立

• 批准号: 06760057
• 负责人: 渡辺 正巳
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760057/
• 关键词: グルタミン酸脱水素酵素; プロトプラスト; Brassica napus

ナタネの葉を切り刻み25Cで一晩放置し、GDH7を誘導させた。この操作によって葉の老化が進行しアンモニアが生成してGDH7は特異的に誘導された。GDHの分離精製は35%硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、調整用電気泳動の順に行った。その結果、精製倍率は400倍となりSDS-PAGEを行ったところ1本のバンドとして確認された。GDH1及びGDH7の基質に対するKm値を比較検討した結果、両者に著しい差異は認められなかった。PAS染色したところ発色が確認されたことより糖タンパク質であることが示唆された。現在、GDH1及び7の抗体を作成するために大量に精製中である。GDH1及び7はそれぞれα、βサブユニットから構成されており、二次元電気泳動によって両者を分離し、免疫学的性質を比較し、ウェスタンブロット法で両者の発現調節機構の解明を計画中である。GDH1及び7アイソザイムの酵素化学的性質に著しい差異は認められなかったことから、両者の遺伝子をクローニングして遺伝子レベルでの発現調節機構を解明するために、葉肉プロトプラストからmRNAを単離し、cDNAのクローニングを試みた。λシャロンベクターを用いEcoRI,NotIの接着末端からディレクショナルクローニングを試みた。しかしながら、遺伝子のクローニングは初心者のため実験系のセッティングに手間取りライブラリーの作成までに留まった。今後、イネの3′末端を含むcDNAをプローブとしてナタネのGDH遺伝子をスクリーニングすることを計画中である。

The leaves are cut off at 25C for one night and GDH7 for one night. The operation of this kind of aging is proceeding without any delay. GDH7 is specially induced. GDH separation and purification of 35% sulfur, water, exchange, adjustment of electrical behavior The results were confirmed by SDS-PAGE at a magnification of 400. GDH1 and GDH7 matrix Km comparison results, differences PAS staining is a confirmation of the presence of the enzyme. Now, GDH1 and GDH7 antibodies are produced in large quantities. GDH1 and GDH 7 are composed of α and β molecules, and the molecular structure of GDH 1 and GDH 7 is compared with that of GDH 2. The differences in the chemical properties of GDH1 and GDH7 enzymes were identified in the expression regulatory mechanisms of the mesophyll, mesophyll and mesophyll proteins, mRNA and cDNA.λThe first step is to create a system that allows users to access information from their own devices. In the future, the 3′-terminal cDNA of the gene will be transferred to the GDH gene of the gene.