ナタネ葉肉プロトプラストの窒素代謝とGDHアイソザイムの特異的誘導に関する研究

油菜叶肉原生质体氮代谢及GDH同工酶特异性诱导研究

• 批准号: 07760061
• 负责人: 渡辺 正巳
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760061/
• 关键词: グルタミン酸脱水素酵素; プロトプラスト; 老化; Brassica napus

ナタネの葉を切り刻み25℃で一晩放置し、GDH7を誘導させた。この操作によって葉の老化が進行しアンモニアが生成してGDH7が特異的に誘導された。GDHの分離精製は40%硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、調整用電気泳動の順に行った。その結果、精製倍率は500倍となりSDS-PAGEを行ったところ1本のバンドとして確認された。GDH1およびGDH7の基質に対するKm値を比較した結果、両者に著しい差異は認められなかった。GDH1からマウスの抗体を作成してウエスタンブロット法で、葉および葉肉プロトプラストにおける発現を現在解析中である。GDH7の抗体を作成しようとしたところ、1種類の不純タンパク質が確認され精製の手段を検討中である。GDH1およびGDH7アイソザイムの酵素化学的性質に著しい差異は認められなかったことから、両者の遺伝子をクローニングして遺伝子レベルでの発現調節機構を解明するために、葉肉プロトプラストからmRNAを単離し、cDNAのクローニングを試みた。λシャアロンベクターを用いEcoR1,Not1の接着末端からディレクショナルクローニングを試みた。しかしながら、ライブラリーの構築がうまく行かず遺伝子のクローニングには成功しなかった。

The leaves are cut at 25℃ for one night, and GDH7 is induced. The aging of the leaves in this operation is progressing and the generation of GDH7 is specifically induced. The separation and purification of GDH are carried out by 40% sulfur extraction, water extraction, exchange, adjustment and electric migration. SDS-PAGE was performed at 500 times the purity of the product. GDH1 and GDH7 matrix Km comparison results and differences GDH1 antibody production process, leaf and mesophyll development process GDH7 antibody production process, 1 type of impurity, quality confirmation and purification methods are under discussion. The enzyme chemistry of GDH1 and GDH7 is characterized by differences in the expression and regulation of mRNA and cDNA in the mesophyll and mesophyll. EcoR1,Not1 and the next terminal are used in the test. The structure of the film is very successful.