ナタネ葉肉プロトプラストの窒素代謝とGDHアイソザイムの特異的誘導に関する研究

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ナタネの葉を切り刻み25℃で一晩放置し、GDH7を誘導させた。この操作によって葉の老化が進行しアンモニアが生成してGDH7が特異的に誘導された。GDHの分離精製は40%硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、調整用電気泳動の順に行った。その結果、精製倍率は500倍となりSDS-PAGEを行ったところ1本のバンドとして確認された。GDH1およびGDH7の基質に対するKm値を比較した結果、両者に著しい差異は認められなかった。GDH1からマウスの抗体を作成してウエスタンブロット法で、葉および葉肉プロトプラストにおける発現を現在解析中である。GDH7の抗体を作成しようとしたところ、1種類の不純タンパク質が確認され精製の手段を検討中である。GDH1およびGDH7アイソザイムの酵素化学的性質に著しい差異は認められなかったことから、両者の遺伝子をクローニングして遺伝子レベルでの発現調節機構を解明するために、葉肉プロトプラストからmRNAを単離し、cDNAのクローニングを試みた。λシャアロンベクターを用いEcoR1,Not1の接着末端からディレクショナルクローニングを試みた。しかしながら、ライブラリーの構築がうまく行かず遺伝子のクローニングには成功しなかった。