微生物由来アルデヒド還元酵素の構造・機能解析

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1.アルデヒド還元酵素遺伝子の大腸菌での発現アルデヒド還元酵素をコードするcDNAをSporobolomyccs salmonicolorより単離し、mRNAからPCR法を用いてcDNAを合成し、大腸菌内で発現させることを試みた。本菌からtotalRNAおよびmRNAを精製し、これらをtemplateRNAとして逆転写反応を行い、cDNAを作製した。次に、PCR法を用いて、目的とするDNA断片を増幅させた。このDNA断片を電気泳動的に分離し、オリゴヌクレオチドプローブとサザンハイブリダイズする断片を確認した。さらに、この断片を制限酵素を用いて、消化した後、回収した。次に、同じ制限酵素で消化したベクタープラスミドとライゲーションを行い、組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、アルデヒド還元酵素の発現を行った。タンパク質の発現を、精製アルデヒド還元酵素に対する抗体を用いたウェスタンブロット法などで確認した。酵素活性についても、反応時における基質および生成物の測定を行って確認することができた。2.X線結晶解析のための結晶化の検討タンパク質の高次構造解析を行うためにX線結晶解析法を試みた。本酵素は硫安添加により結晶化することが判明していたため、ハンギングドロップ法により硫安添加条件の検討を行い、X線結晶解析に適合する六角両錘形の結晶が得られた。この結晶を用いて、プレセッション写真の撮影・解析を行い、格子定数等の決定を行った。