微生物由来アルデヒド還元酵素による4-ハロアセト酢酸エステルの不斉還元

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AR遺伝子の大腸菌での発現 アルデヒド還元酵素(AR)をコードするcDNAを大腸菌内で発現させることを試みた。Sporobolomyces salmonicolorよりtotalRNAおよびmRNAを精製し、これらをtemplateRNAとして逆転写反応を行い、cDNAを作製した。次に、PCR法を用いて、目的とするDNA断片を増幅させ、このDNA断片を電気泳動的に分離し、オリゴヌクレオチドプローブとサザンハイブリダイズする断片を得た。さらに、この断片を制限酵素を用いて消化し、同じ制限酵素で消化したベクタープラスミドpKK223-3とライゲーションを行い、組換えプラスミドpKARを得た。この組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、ARの発現を行った。ARは通常用いられる濃度より低い0.1mMのIPTGの添加により充分誘導された。ARを発現させた大腸菌を用いる4-クロロアセト酢酸エステル(CAAE)の不斉還元反応 ARを大量発現させた大腸菌の休止菌体を用いてCAAEの不斉還元反応の検討を行った。まず、還元反応に必要な添加物の検討を行ったところ、NADPH再生に必要なNADP^+、グルコース脱水素酵素、グルコースの添加が必要であった。また、水-有機溶媒2相系システムの導入を行うことにより、基質・生成物による反応阻害を回避することができ、より効率のよい(R)-4-クロロ-3-ヒドロキシブタン酸エステル(R-CHBE)への不斉還元反応を行わせることができた。最終的には、300mg/mlのCAAEから収率85%で257mg/mlのCHBEが48時間の反応で得られた。このときの生成物の光学純度は91%eeであった。