腸管上皮細胞のタイトジャンクションにおける物質透過を抑制する食品由来因子の解析

抑制肠上皮细胞紧密连接物质渗透的食物源性因子分析

• 批准号: 06760129
• 负责人: 橋本 啓
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of Shizuoka
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760129/
• 关键词: Caco-2; スクラーゼ; ペプチド輸送; タイトジャンクション; β-カゼイン; アクチンリング

1.ヒト大腸癌由来培養細胞株Caco-2の無血清培養株であるCaco-2-SFの機能特性について検討した。Caco-2-SFは培養4日目にコンフル-エントに達し、10日目にはスクラーゼ活性が顕著に発現した。Gly-Glyと共輸送されるH^+の細胞内濃度を蛍光色素により測定することでペプチド輸送活性を測定したところCaco-2-SFはCaco-2と同様な活性を示した。細胞を透過性膜上に3日間培養した後経上皮電気抵抗(TEER)を測定したところ、300Ω-cm^2以上の高いTEER値を示した。しかし、細胞層をハンクス液でリンスした後TEERを測定したところその値は100Ω-cm^2以下にまで減少していた。このことからCaco-2-SFはタイトジャンクション(TJ)を形成しているが不安定であることが明らかとなった。一方、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加し1時間インキュベートする事によりTJが安定化された。そこでこのCaco-2-SFを用いたアッセイ系によりTJ安定化活性を持つ食品蛋白質を検索した。2.様々な食品蛋白質あるいはその酵素分解物についてアッセイした結果β-カゼイン-トリプシン分解物(β-CN-T)に強いTEER上昇活性、即ちTJ安定化活性が見られた。そこで、β-CN-Tを逆相短カラムにより分画しアッセイした結果、50%アセトニトリルにより溶出された画分に強いTJ安定化活性が認められた。逆相HPLCによる分離なども試みたが活性ペプチドを単離する事は出来なかった。3.ロ-ダミン・ファロイジンによりアクチンリング(AR)を蛍光染色した結果Caco-2-SFもCaco-2と同様なARを形成していることが示唆された。また、サイトカラシンDにより細胞を処理したところβ-CN-Tの活性が抑制された。以上より、β-CN-TによるTJの安定化機構に細胞骨格を介した経路も関与していることが示唆された。各種TJ関連蛋白質のmRNA量の変化や蛋白リン酸化程度の変化については本年度内に完了することは出来なかった。

1. The functional characteristics of Caco-2-SF in serum-free culture of colorectal cancer-derived cell line Caco-2 were investigated. Caco-2-SF was incubated for 4 days, and the activity of Caco-2-SF was detected for 10 days. The intracellular concentration of Gly-Gly co-transport of H^+ was determined by measuring the transport activity of Caco-2-SF Caco-2. Cell permeability was measured after 3 days of culture, and high TEER values above 300Ω-cm^2 were indicated. The cell layer was removed from the TEER and the value was reduced to 100Ω-cm^2. Caco-2-SF is not stable. One prescription, 10% fetal serum (FCS) is added to the TJ stabilization system. Caco-2-SF is used to stabilize TJ activity and to detect food proteins. 2. For food protein, the enzyme decomposition product (β-CN-T) has strong TEER increasing activity, i.e. TJ stabilizing activity. In addition, β-CN-T reverse phase short-term dissolution test results, 50% dissolution test results, strong TJ stabilization activity test results. Reverse-phase HPLC separation of active substances 3. Caco-2-SF and Caco-2-AR were formed in the process of light staining. The activity of β-CN-T is inhibited by cell processing. The above β-CN-T stabilization mechanism of TJ is closely related to the pathway of TJ. Changes in mRNA levels of various TJ-related proteins and changes in protein acidification were completed during the year.