沿岸海洋微細プランクトン群集中に占めるメタン資化細菌細胞の検出と計測

沿海海洋微型浮游生物群落中甲烷同化细菌细胞的检测和测量

• 批准号: 06760169
• 负责人: 難波 謙二
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760169/
• 关键词: メタノトローフ; メタン

海洋環境から得られたメタン資化細菌の培養株を用い、透過型電子顕微鏡によりメタン資化細菌の観察を行う過程で、最適な固定、包埋、薄切及び染色の方法を検討することから開始した。固定にはアクロレインとグルタールとを用いたが、グルタールのみで充分な固定が行われるので取り扱いの手軽さからグルタールのみを用いた。また、海水の浸透圧を考慮し、緩衝液に0.1Mカコジル酸+0.25M NaCl pH6.85を用いた。50mlの培養に3.5mlの8%グルタールを添加し、1500xgで遠心し集菌した後、等容量の3%グルタール緩衝液溶液で2時間前固定を行った後、緩衝液で5回洗浄した。後固定はサンプルと等量の1%オスミウム緩衝液溶液2時間で行い、蒸留水で5回洗浄を行った。続いてサンプルペレットをアガロース包埋した。溶解しておいた2%アガロースをほぼ等容量加え、1500xgで遠心した。細切した後、エタノールシリーズ(50,70,90,95,100,100)で脱水、プロピレンオキサイドで置換ののち樹脂を浸透した。樹脂はエポキシQueto1812を用いたが、混合比6:4、5:5、4:6を試みたところガラスナイフでは5.5が最も適当であった。観察は酢酸ウランとクエン酸鉛で染色した後、日本電子製透過電顕1200EXを用いた。以上の方法でメタン資化細菌細胞の観察と内膜構造による判別はできることが判明した。しかし、計数となると、いくつかの問題点があることも分かった。一つは、寒天包埋の段階で集められる細胞に偏りが生じることである。遠心により集めると、比重の違いにより分別が生じてしまい、その後のプロセスで用いる1ミリ立方程度の体積では全体を代表させるのは困難であると考えられた。また、連続した切片のうちの一つの切片を観察できる数が、細胞がまばらに分布していると有意な値となる程度の計数値が得られないことも問題であった。寒天包埋時の遠心の回転数を高く設定することで解決を試みたが、寒天の比重の問題もあって現有の遠心機では解決しなかった。以上2つの問題を解決するために、フィルターによる集菌ののち一連のプロセスを行うことを試みているところである。

This paper begins with a discussion of the use of cultured strains of cultured bacteria in marine environments, the observation process of cultured bacteria by transmission electron microscopy, and the optimal methods for fixation, embedding, slicing and staining. A fixed number of items are available in the middle of the table. In addition, the penetration pressure of seawater should be considered, and the buffer solution of 0.1M hydrochloric acid +0.25M NaCl pH 6.85 should be used. 50ml of culture medium 3.5 ml of 8% agar solution was added, 1500 x g of agar solution was added, and the same volume of 3% agar buffer solution was added 2 hours ago. After fixation, the same amount of 1% of the buffer solution was used for 2 hours, and the distilled water was used for 5 times.続いてサンプルペレットをアガロース包埋した。Dissolution of 2% After fine cutting, the resin (50,70,90,95,100,100) is dehydrated, and the resin is soaked. The resin was mixed with Queto1812 in a ratio of 6:4, 5:5, 4:6. The resin was mixed with Queto 1812 in a ratio of 6:4, 5:5, 4:6. After observing the lead acid dye, the Japanese electronic system transmitted electricity 1200EX. The above methods can be used to detect the structure of the inner membrane of the cultured bacterial cells.しかし、计数となると、いくつかの问题点があることも分かった。A The distance between the center and the center of gravity is different. The distance between the center and the center of gravity is different. The distance between the center and the center of gravity is different. The number of cells in a slice is determined by the number of cells in the slice. When the cold weather is buried, the number of remote centers is set to be high. The above two problems are solved by the following methods: