遺伝子操作によるウエルシュ菌α毒素の亜鉛結合部位と作用の解析

通过基因操作分析产气荚膜梭菌α-毒素的锌结合位点和作用

• 批准号: 06770211
• 负责人: 永浜 政博
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokushima Bunri University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770211/
• 关键词: ウエルシュ菌; α毒素; ホスフォリパーゼC; 部位特異変異法; ヒスチジン; 亜鉛; リガンド; 金属タンパク質

ウエルシュ菌α毒素は、致死、壊死、溶血、ホスホリパーゼC(PLC)活性等を示す。α毒素は、分子内にZnを有する金属タンパクで、Znが活性発現に重要であることが報告された。一方、α毒素のアミノ酸配列と相同性が高いセレウス菌PLCのX線解析から、α毒素は分子内に3個のZnが存在し、それらは特定のHis残基を含むのアミノ酸残基にリガンドされていると推察された。今回、毒素分子中に存在する9個のHis残基すべてを部位特異変異法でGlyに置換した変異毒素遺伝子を作成し、枯草菌を用いて発現、精製後、α毒素と各変異毒素の活性を比較し、各His残基の役割を解析した。その結果、H68G、H126G、H136G、H148Gの変異毒素は、溶血、致死、PLC活性が著しく減少したが、46、207、212、241位のHis残基の変異毒素は活性の変化は認められず、H11Gは毒素の発現が認められなかった。このうち、α毒素とH148Gは、3mM Ca存在下で赤血球膜に結合したが、H68G、H126G、H136Gは結合せず、さらに、H148Gは本毒素の溶血活性を阻害した。α毒素、H68G、H126G、H136Gは分子内に2個のZnを有していたが、H148Gは1個であった。一方、^<65>Znはα毒素とH148Gに結合したが、H68G、H126G、H136Gには結合しなかった。以上の結果から、α毒素の68、126、136、148位のHis残基は毒素活性発現に重要なZnのリガンドであると考えられる。このうち、68、126、136位のHis残基は、はずれやすい3番目の金属イオンのリガンドで、毒素の結合に重要であると考えられ、148位のHis残基の結合には関与せず、作用発現に重要な2番目のZnの強力なリガンドであると思われる。一方、H11Gは発現しないことから、11位のHis残基は、毒素の構造維持に重要な1番目のZnのリガンドと推察される。

Bacterial alpha toxin has been shown to be lethal, necrotic, hemolytic, and C (PLC) activity.α-toxin, intramolecular Zn, metal, Zn, activity, important X-ray analysis of the α-toxin showed that there were three Zn residues in the α-toxin molecule, and some of them contained specific His residues. There are nine His residues in the toxin molecule, and the site-specific method is used to make the Gly substitution and the isotoxin gene. After the production and purification of the toxin, the activity of the alpha toxin and the isotoxin is compared. The cleavage of each His residue is analyzed. The results showed that H68G, H126G, H136G, H148G isotoxins, hemolytic, lethal, PLC activity decreased, His residues at positions 46, 207, 212, 241 isotoxins activity decreased, H11G isotoxins activity decreased. In the presence of 3 mM Ca, α toxin and H148G bound to erythrocyte membrane, H68G, H126G and H136G bound to erythrocyte membrane, and H148G inhibited hemolytic activity of α toxin.α toxin, H68G, H126G and H136G have two Zn atoms and one H148G atom. One side,^Zn α toxin H148G, H68G, H126G, H136G<65>The above results show that His residues at positions 68, 126, 136 and 148 of α toxin are important for toxin activity. His residues at positions 68, 126, and 136 are important for binding to toxins and metals at positions 3 and 148, respectively. H11G residues are important for the structural maintenance of the toxin.

项目成果

櫻井 純,永浜政博,越智定幸: "ウエルシュ菌α毒素の作用" 日本細菌学雑誌. 49. 719-736 (1994)

Jun Sakurai、Masahiro Nagahama、Sadayuki Ochi：“产气荚膜梭菌 α 毒素的影响”《日本细菌学杂志》49. 719-736 (1994)。

M.Nagahama,Y.Okagawa,T.Nakayama,E.Nishioka and J.Sakurai: "Site-directed mutagenesis of histidine residues in Clostridium perfringens alpha-toxin" J.Bacteriol.177. 1179-1185 (1995)

M.Nagahama、Y.Okakawa、T.Nakayama、E.Nishioka 和 J.Sakurai：“产气荚膜梭菌 α 毒素中组氨酸残基的定点诱变”J.Bacteriol.177。