あて材形成中の木部分化帯において特異的に発現する遺伝子の単離・同定

点击翻译按钮获取中文摘要

傾斜固定後1時間のあて材形成初期に発現している遺伝子のcDNAの単離を試みた。全RNAの抽出はさらに改良し、VRC(Vanadyl Ribonucleoside Complex)を抽出用緩衝液に加えることによって、安定的にしかも夾雑物の少ない全RNAを得られるようになった。傾斜固定後1時間の樹幹上側の木部分化帯から抽出した全RNAをOligo-dT Cellulose スパンカラム(Pharmacia)に通し、mRNA画分を得た。得られたmRNAからTimesaver(Pharmacia)を用いてcDNA二重鎖を合成し、これをλgtllに組み込みGigapack II Gold(Stratagene)を用いてパッケージング、99.9%以上の転換効率で形質転換体ファージによるcDNAライブラリを構築した。このライブラリは約50,000クローンからなり、1回増幅させて約10^<10>pfu/mlのタイタ-を得た。他方、同じく傾斜固定後1時間の木部分化帯から得られたmRNAをテンプレートにOligo-dTをプライマーとし、Superscript(BRL)を用いて^<32>P-α-dCTPを取り込ませてcDNAを合成し、これをSubtractor II(Invitrogen)を用いて鉛直に成長中の木部分化帯から得られたmRNAによってサブトラクションした。サブトラクションは2回行い、^<32>Pの放射活性を測定したところ、1回目で約13%、2回目で約3.8%の効率でサブトラクションされた。得られた^<32>PラベルのサブトラクテドcDNAをプローブとして用い、先に構築したcDNAライブラリの2×10^5 plaqueに対してプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行なった。スクリーニングの結果、48個のポジティブプラークが得られた。