あて材形成中の木部分化帯において特異的に発現する遺伝子の単離・同定

木材形成过程中木质部分化区特异表达基因的分离和鉴定

• 批准号: 06856022
• 负责人: 馬場 啓一
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06856022/
• 关键词: Tension Wood; gene expression; cDNA cloning; Subtraction

傾斜固定後1時間のあて材形成初期に発現している遺伝子のcDNAの単離を試みた。全RNAの抽出はさらに改良し、VRC(Vanadyl Ribonucleoside Complex)を抽出用緩衝液に加えることによって、安定的にしかも夾雑物の少ない全RNAを得られるようになった。傾斜固定後1時間の樹幹上側の木部分化帯から抽出した全RNAをOligo-dT Cellulose スパンカラム(Pharmacia)に通し、mRNA画分を得た。得られたmRNAからTimesaver(Pharmacia)を用いてcDNA二重鎖を合成し、これをλgtllに組み込みGigapack II Gold(Stratagene)を用いてパッケージング、99.9%以上の転換効率で形質転換体ファージによるcDNAライブラリを構築した。このライブラリは約50,000クローンからなり、1回増幅させて約10^<10>pfu/mlのタイタ-を得た。他方、同じく傾斜固定後1時間の木部分化帯から得られたmRNAをテンプレートにOligo-dTをプライマーとし、Superscript(BRL)を用いて^<32>P-α-dCTPを取り込ませてcDNAを合成し、これをSubtractor II(Invitrogen)を用いて鉛直に成長中の木部分化帯から得られたmRNAによってサブトラクションした。サブトラクションは2回行い、^<32>Pの放射活性を測定したところ、1回目で約13%、2回目で約3.8%の効率でサブトラクションされた。得られた^<32>PラベルのサブトラクテドcDNAをプローブとして用い、先に構築したcDNAライブラリの2×10^5 plaqueに対してプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行なった。スクリーニングの結果、48個のポジティブプラークが得られた。

1 time after tilt fixation, the cDNA of the gene appeared in the early stage of material formation. VRC(Vanadyl Ribonucleoside Complex) is a buffer for extraction of whole RNA. One day after the tilt fixation, the total RNA of the upper part of the trunk was extracted, and the mRNA was extracted. The gene expression of Timesaver(Pharmacia) was synthesized by cDNA double locking, and the gene expression of Gigapack II Gold(Stratagene) was constructed by cDNA double locking with a conversion rate of more than 99.9%. This is about 50,000 pfu/ml and 1 <10>pfu/ml. 1 time after fixation, the mRNA was synthesized by Oligo-dT (BRL) and <32>Subtractor II(Invitrogen), and the mRNA was synthesized by Oligo-dT (BRL). The <32>radioactivity of P was measured in 2 cycles, 1 cycle and 2 cycles, respectively. The radioactivity was about 13% and 3.8%. In <32>order to obtain the cDNA for the first time, we constructed the cDNA for the second time and constructed the cDNA for the second time. The results of the search, 48 search results were obtained.