血管内皮の張力刺激に対するストレスファイバー形成メカニズムの解明

阐明响应血管内皮张力刺激的应力纤维形成机制

基本信息

批准号：
06858078
负责人：
武政徹
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

血管内皮の張力を受けストレスファイバーを形成し、しっかりと下部組織にはり付く過程で、何がおこっているのかを分子生物学的に探るのが本研究の目的である。阻害剤を使った予備的な実験で、血管内皮細胞の張力刺激に対するストレスファイバー形成に蛋白質のリン酸化が必須である事が示唆された。そこでまずラット生体から取り出した血管を用い、リン酸化チロシン抗体を使って張力刺激とリン酸化との因果関係を蛋白化学的に調べたところ、張力刺激により、90kDa付近の蛋白質(のチロシン残基)がリン酸化されることがわかった。さらにこの蛋白質の詳細な分子生物学的解析をするにあたっては、ラットから取りだした血管の内皮は量的にもまた精製度から言ってもそのまま使うには材料として不適当であると考えられた。そこで今回はヒト臍帯の静脈から血管内皮細胞の培養系を樹立しそれを薄いシリコンラバー上に培養して進展させ、まず上記のIn situの実験がIn vitroで再現できるか試みた。実際はステッピングモーターを使った培養細胞伸展装置を作成するのにかなりの時間をかけてしまったが、装置を完成させ、血管内皮細胞に継続的、もしくは周期的な張力刺激を与えることによって生体から取り出した血管と同じような形態変化を起こすことに成功した。今後は張力刺激を受けた細胞から蛋白質を抽出し、注目しているリン酸化蛋白質を電気泳動で分離同定後、切り出してアミノ酸配列を決定し既存の蛋白質と比較する。その後、新蛋白質であれば合成ペプチドで抗体を作らせ蛋白質の性質を明らかにするとともに、その抗体を使ってライブラリーをイムノスクリーニングにかけ、遺伝子をクローニングし、分子生物学的解析を進めていく予定である。

这项研究的目的是分子在生物学上探讨正在发生的事情，因为血管内皮的张力形成压力纤维，并牢固地粘在较低的组织上。对抑制剂的初步实验表明，蛋白质磷酸化对于刺激血管内皮细胞张力的应激纤维形成至关重要。首先，我们使用从大鼠生物体中提取的血管使用磷酸化的酪氨酸抗体研究了张力刺激与磷酸化之间的因果关系，并发现张力刺激刺激磷酸化蛋白（酪氨酸残基）约为90 kDa。此外，在对该蛋白的详细分子生物学分析中，从大鼠中提取的血管内皮被认为是不适当的，无论是在定量和纯化方面都可以使用的材料。这次，我们从人脐带的静脉建立了一种血管内皮细胞的培养系统，并将它们在薄硅橡胶上进行了培养以进展，并首先试图查看是否可以在体外复制上述原位实验。实际上，使用步进电动机创建培养的细胞扩展装置花了很长时间，但是通过完成该装置，我们成功实现了与从活体中从活体中移除的血管相似的形态变化，通过将连续或周期性的张力刺激应用于内皮细胞。将从张力刺激的细胞中提取蛋白质，并通过电泳分离并鉴定出感兴趣的磷酸化蛋白质，然后切除以确定氨基酸序列并与现有蛋白质进行比较。之后，如果它是一种新蛋白质，则将使用合成肽产生抗体来阐明蛋白质的特性，并且将使用抗体进行免疫术，将基因克隆，并进行分子生物学分析。