無血清培養による臼歯歯胚の歯根形成、特に細胞分化・セメント質形成に関する研究

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下顎骨と歯小嚢を伴う萠出直前の生後14日齢マウス下顎第一臼歯を摘出し、無血清BJGb培地で最大42日間の培養を行った。(1)培養液の検討:培養中の細胞合成活性の維持を目的に基本培地組成の改良を試みた。アスコルビン酸からL-アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩への変更、Linoleic Acid, Bovine Serum Albumin添加により良好な結果を得た。(2)培養下で歯根に形成されたセメント質様基質の検索:A)透過型電子顕微鏡;セメント質様基質に包埋された細胞の細胞内小器官の分布や発達状況、また細胞周囲に見られるコラーゲン線維の走行やmatrix vesicleの分布などの特徴はin vivoの有細胞セメント質に見られる構造と類似していた。B)免疫組織化学;in vivoではcollagen type I, IIIが歯根膜に存在するが、歯根象牙質・歯槽骨・セメント質はcollagen type IIIが欠如した。培養下で観察されたセメント質様基質やその周囲の構造にもこれと同様な反応が見られた。C) Electron Prove Micro Analysis;歯根象牙質と同様、セメント質様基質においてもリンとカルシウムのピークが確認された。しかしセメント質様基質のピークは象牙質のものより相対的に低く、石灰化の進行が未熟な状態であると推測された。(3)外因性因子の検討:石灰化促進因子としてNa-β-Glycerophsphate, Dexamethasone、成長因子としてEGF, TGF-β1を添加して培養した。各因子の添加においてもセメント質形成初期の特徴は観察されたが、石灰化の進行は未熟な状態に留まった。(4)分子生物学的手法による研究:RT-PCRに供するためin vivo, in vitroの各発達ステージの試料を収集中である。また効率良いRNA回収のための組織の粉砕法についても検討中である。