ヒト歯髄細胞の三次元的培養に関する基礎的研究

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細胞外マトリックスを用いた三次元的細胞培養としてコラーゲン・ゲル包埋培養法を行った。コラーゲン混合溶液の調製は、豚腱由来Type1 collagen(3mg/ml, pH3.0)8容量に10倍濃度のEagle' MEM1容量をよく混合し、ついで再構成用緩衝液(2.2%NaHCO3, 200mM HEPESを含む0.05N NaOH)を1容量加え混ぜた後、カルチャー・ディッシュに分注し、CO2インキュベータ-内でゲル化させてBase Layerとした。ヒト歯髄細胞(DP細胞)は、臨床的に健全な新鮮抜去歯の歯髄組織を培養してout growthしてきた線維芽細胞様細胞を使用した。細胞分散液を調製し、冷却しながらコラーゲン混合溶液中に加えよく混合後、DP細胞・コラーゲン混合溶液をBase layer上に分注し、直ちにゲル化させCell Layerとした。ゲル形成後、培養液(Overlay medium)を重層し、通常の単層培養法と同様に培養を行った。コラーゲン・ゲル内培養におけるDP細胞の形態的変化を位相差顕微鏡により観察した。ゲル内培養開始後、初期の段階まではDP細胞の形態は球形であったが、その大きさは通常の単層培養のそれと比較した場合やや小さめであった。その後、徐々に進展を開始し、通常の単層培養のそれと比較して、長い2極性の形態を示していた。このことから、DP細胞は再構成されたコラーゲン線維と立体構造の中で細胞形態を大きく変化させることが明らかとなった。その理由として、通常の単層培養においては細胞の接着面の底面だけに限定されるのに対して、今回試みたコラーゲン・ゲル包埋培養では三次元的構造をとっていることから、細胞の周囲全体の接着面が与えられたためと考えられる。現在、培養終了後回収したDP細胞からDNAおよびmRNAを抽出し、遺伝子レベルで、単層培養との比較検討を進めている。