物理的刺激が骨芽細胞と破骨細胞に及ぼす影響-分子生物学的検討-

物理刺激对成骨细胞和破骨细胞的影响 - 分子生物学研究 -

• 批准号: 07772033
• 负责人: 小牧 憲明
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772033/
• 关键词: 遠心力負荷; パルス電磁場刺激; ヒト由来骨芽細胞様細胞; 破骨細胞; 細胞内情報伝達経路; Prostaglandin; 石灰化能; 骨吸収能

1)骨芽細胞ならびに破骨細胞の分離・培養:骨芽細胞はヒト正常皮質骨より初代培養法にて採取した。破骨細胞は、1,25(OH)_2D_3を添加してマウス由来骨髄細胞を培養し、形成させた。2)力学的刺激ならびに電気的刺激の負荷:力学的刺激として、500から1500回転の遠心力を12時間ごとに20分間、また、電気的刺激として、パルス電磁場発生装置を用いて、0から7ガウスのパルス電磁場刺激を連続的に負荷した。3)細胞内情報伝達経路の検討:各種細胞内情報伝達経路の特異的阻害剤を添加し、物理的刺激に対する反応性の変化を検討した。4)分子生物学的検討;各種条件下で培養を行った細胞のmRNAを抽出し、ノーザンブロッティング法による解析を行い、各種細胞内情報伝達物質のmRNAを検索した。5)物理的刺激が骨芽細胞・破骨細胞に及ぼす影響の評価・骨芽細胞の評価:ALPase活性、BGP産生能を測定し、分化過程を評価した。さらにVon Kossa染色を施し、画像解析装置を用いて石灰化量を定量化した。・破骨細胞の評価:TRACP染色を行いその形成数を測定し形成能を評価した。さらに破骨細胞をdentine slice上で培養してその吸収窩を染色し、画像解析装置を用いて吸収面積を定量化した。6)結果ならびに考察:遠心力負荷により、骨芽細胞のALPase活性、BGP産生能は負荷量依存的に上昇したが、石灰化能に顕著な変化は認められなかった。また、破骨細胞形成能と吸収能にも変化は認められなかった。パルス電磁場刺激により、骨芽細胞のALPase活性は刺激強度依存的に上昇したが、BGP産生能は抑制された。骨芽細胞の石灰化能ならびに破骨細胞の形成能と吸収能は、わずかに上昇する傾向が認められた。細胞内情報伝達経路の検討のため、骨芽細胞培養系にindomethacinを添加すると、添加濃度依存的に物理的刺激に対する反応性は減少した。また、Calphostin Cを添加してもその反応性の変化は認められなかった。以上の結果から、物理的刺激は、骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、proteinkinase Cは関与していないことが示唆された。ノーザンブロッティング法により解析した結果、prostaglandinに関与するmRNA量がわずかに増加する傾向が認められた。破骨細胞培養系に顕著な変化は認められなかったが、prostaglandin産生が関与していたことから、骨芽細胞を介して反応している可能性が示唆された。また、両刺激により骨芽細胞が異る反応性を示したことから、反応経路が異る可能性も示唆された。今後、両刺激に対する反応経路の違いや、細胞内情報伝達物質についてさらに詳細な検討を加えて行く予定である。

1)Isolation and culture of osteoclasts from bone bud cells: Primary culture method of osteoclasts from normal cortical bone Osteoclasts were cultured and formed by adding 1,25(OH)_2D_3 to osteoclasts. 2)Mechanical stimulation and electrical stimulation load: mechanical stimulation, 500 cycles, 1500 cycles, 12 minutes, electrical stimulation, 20 minutes, electrical electromagnetic field generator, 0 minutes, 7 minutes, electrical electromagnetic field stimulation load. 3)Study of intracellular signaling pathways: A variety of intracellular signaling pathways specific inhibitors are added to physical stimuli to respond to changes in signaling pathways. 4) Molecular biology study: mRNA extraction from cultured cells under various conditions, analysis of mRNA in various intracellular information transfer substances. 5)Evaluation of the effects of physical stimulation on osteoblasts and osteoclasts: determination of ALASE activity, BGP production, and differentiation Von Kossa staining and image analysis equipment were used to quantify the amount of lime. Evaluation of osteoclasts:TRACP staining, determination of the number of osteoclasts and evaluation of osteoclast formation In addition, osteoclasts were cultured on a dentine-slice, the absorption wells were stained, and the image analysis device was used to quantify the absorption area. 6)The results showed that: the load of remote stress, the activity of ALase in bone bud cells, the load-dependent increase of BGP production energy, and the change of calcification energy were investigated. The osteoclast formation energy and absorption energy can be used to recognize the osteoclast. The activity of ALPG in bone bud cells increased in response to electromagnetic field stimulation, while BGP production was inhibited. Calcification energy of bone bud cells and osteoclast formation energy tend to increase. Intracellular signaling pathways were investigated and bone bud cell cultures were treated with indomethacin and concentration-dependent physical stimuli Calphostin C is added to the list of anti-corruption activities. The results showed that physical stimulation promoted the differentiation of bone bud cells, and the production of prostaglandin was related to proteinase C. The results of the analysis and the increase of mRNA levels in prostaglandin-related genes were identified. Osteoclast cell culture system is the first to recognize the relationship between prostaglandin production and osteoclast cell culture system. The possibility of different responses to stimulation of bone bud cells was also discussed. In the future, we will discuss in detail the regulation of intracellular signaling pathways and intracellular signaling pathways in response to stimuli.