チトクロームP-450の分子進化に関する研究

细胞色素P-450分子进化研究

• 批准号: 07772180
• 负责人: 斎藤 浩美
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772180/
• 关键词: チトクロームP-450; 両生類; 分子進化

本研究では両生類のチトクロームP-450に着目し、これまでにアフリカツメガエル肝ミクロゾーム画分よりオクチルアミノセファロース、Mono Q (FPLC)およびMono Pカラムクロマトグラフィー(FPLC)を行いpH6.7で溶出される分子量52kDaのチトクロームP-450を精製している。今回この分子種を大量に精製する過程で、最終ステップのクロマトフォーカシングで異なる挙動を示すP-450分子(p15.9)を見出した。これら2つのP-450のN末端アミノ酸配列は、決定した15残基までは完全に一致していた。再構成系で薬物代謝活性を調べたところ、両者とも哺乳類のP-450に比べると弱いがアニリン水酸化、アミノピリンN脱メチル化、p-ニトロアニソールO脱メチル化活性が認められ、ヘキソバルビタール水酸化活性は検出されなかった。全体にpI5.9のP-450の活性はpI6.7のP-450よりもやや弱かった。次に精製したP-450 (pI6.7)についてリシルエンドペプチダーゼ消化断片のアミノ酸配列を決定した。これに基づいて合成したプライマーを用いてRT-PCRによりプローブを作製し、アフリカツメガエル肝cDNAライブラリーをスクリーニングした結果、全長2235bp、494残基のアミノ酸をコードするクローンを得た。この配列を他種生物のP-450と比較すると、ラットのCYP2G1と55%のホモロジーを示したのをはじめ、CYP2ファミリーとの間により高い相同性が認められた。一方、P-450 (pI6.7)の精製標品をウサギに免疫して抗血清を調製し、さらにアフィニティー精製した抗体を用いてイムノブロッティングを行い、このP-450を定量するシステムを構築した。今後、この系を用いてアフリカツメガエルの変態前後の各ステージにおけるこのP-450分子の発現パターンを調べ、生活環境の変化との対応について検討していきたい。また、pI5.9のP-450分子についても同様に解析を進める予定であり、この2種のP-450を識別する際に等電点電気泳動が有効な手段になると考えられる。

In this study, we investigated the molecular weight of Mono Q (FPLC) and Mono P (FPLC), which were extracted from P-450 at pH 6.7. The molecular weight of Mono Q (FPLC) was 52 kDa. The molecular species were purified in large quantities, and finally P-450 molecule (p15.9) was identified. The N-terminal amino acid sequence of P-450 is completely consistent with that of P-450. The metabolic activity of these compounds is regulated by the P-450 in mammals, and the activity of these compounds is regulated by the P-450 in mammals, and the activity of these compounds is regulated by the P-450 in mammals. All pI5.9 and P-450 activity are pI6.7 and P-450 activity is weak. The next step is to refine P-450 (pI6.7) and determine the acid alignment of the digestive fragments. This gene was synthesized by RT-PCR, and the results were obtained by RT-PCR. The length of the gene was 2235 bp, and the nucleotide sequence of 494 residues was obtained. This alignment is based on the P-450 of other species compared to CYP2G1 and CYP2G1 and 55% of the species compared to CYP2G1 and CYP2G1. A purified standard of P-450 (pI6.7) was used to prepare and quantify antiserum. In the future, the system will be used to adjust the development of P-450 molecules before and after the change of the living environment. pI5.9 and P-450 molecules are identified by isoelectric point electrophoresis.