分子進化工学的手法を用いたプレニルトランスフェラーゼの鎖延長機構の解明

利用分子进化工程方法阐明异戊烯基转移酶的链延长机制

• 批准号: 07780489
• 负责人: 大沼 信一
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780489/
• 关键词: イソプレノイド; ファルネシル二リン酸合成酵素; ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素

イソプレノイドの生合成に関与しているプレニルトランスフェラーゼは、イソプレニル二リン酸(IPP)とアリル性プライマー基質の連続的縮合反応を触媒する酵素の総称であり、生成物の鎖長により分類され、これまでに10数種類が知られている。しかしこれら個々の酵素が如何にして生成物の鎖長を決定しているかについては全く不明である。そこで、今回、鎖長決定機構を解明するために、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素やファルネシル二リン酸合成酵素などのプレニルトランスフェラーゼ遺伝子にランダムに変異を導入し、In vivo検出系を用いて最終生成物の変化した変異体を作製し、解析を行った。ファルネシル二リン酸合成酵素にランダム変異を導入しゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を持つ変異体をリコペン生産による大腸菌の着色を指標にしたシステムを利用し探索したところ4種類の変異体を得ることができた。これら変異型酵素を解析したところいずれもゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性をIn vitroで示し、3つのアミノ酸が鎖長決定に重要な寄与をしていることが明らかになった。特に初めアスパラギン酸に富んだ領域の5残基上流に存在するチロシンが鎖長決定に直接的に寄与していることが判った。また、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素にランダム変異を導入した場合にも幾つかのより長鎖の生成物を与える変異体が得られこれらの解析から上記アミノ酸がゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の場合にも重要な寄与をしていることを明らかにした。

参与异普尼生物合成的前转移酶是催化异丙基二磷酸盐（IPP）（IPP）和Allicular Primer底物的连续凝结反应的酶的一般术语，并且根据产品的链长度进行分类，并且已知十种已知。但是，这些单个酶如何确定产品的链长度是完全未知的。因此，为了阐明链长度测定的机制，将突变随机引入到前转移酶基因中，例如甘烷基凝激素二磷酸合酶和Farnesyldiph磷酸盐合酶，并使用IN VIVO检测系统制备使用改变最终产物的突变体，并进行了分析。当我们搜索具有随机突变为Farnesyl二磷酸合酶的突变体时，该突变酶用于使用一个系统，在该系统中，使用Lycopene生产的大肠杆菌将具有黄烷基凝集酶的突变体用作大肠杆菌的指标，将四种类型的突变体用作指数。对这些突变酶的分析表明，在体外显示了黄烷基凝蛋白二磷酸合酶活性，表明三种氨基酸对链长的测定重要贡献。特别是，发现最初位于天冬氨酸富含天冬酸的区域上游的酪氨酸直接有助于链长度测定。此外，当将随机突变引入到二磷酸二磷酸二磷酸酯合酶中时，获得了几种给出较长链产物的突变体，这些分析表明，上述氨基酸也有助于香烷基凝血酶二磷酸合成酶。

项目成果

Shingo Fujisaki: "Cloning of a gene from Escherichia coli that confers resistanbce to fosmidomycin as a conseguence of auplification" Gene. (発表予定). (1996)

Shingo Fujisaki：“从大肠杆菌中克隆一个基因，该基因赋予对福米霉素的抗性，作为扩增的结果”基因（即将发表）。

Shinichi Ohnuma: "Identification and Charactrization of Geranylgeraniol Kinase and Geranylgeranyl Phosphate Kinase from the Archaebacterinm Sulfolobus acidocaldarius" Journal of Biochemistry. (発表予定). (1996)

Shinichi Ohnuma：“来自古细菌酸热硫化叶菌的香叶基香叶醇激酶和香叶基磷酸盐激酶的鉴定和表征”生物化学杂志（1996 年）。

Shinichi Ohnuma: "Conversion Flom Farnesyl Diphosphte Synthase to Gevnylgeranyl Diphosphate・synthase by Rardom Chemical Mutagensis" The Journal of Biological Chemistry. (発表予定). (1996)

Shinichi Ohnuma：“通过 Rardom Chemical Mutagensis 将 Flom Farnesyl Diphosphte Synthase 转化为 Gevnylgeranyl Dilicates·synthase”《生物化学杂志》（1996 年）。