分子進化工学的手法を用いたプレニルトランスフェラーゼの鎖延長機構の解明

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イソプレノイドの生合成に関与しているプレニルトランスフェラーゼは、イソプレニル二リン酸(IPP)とアリル性プライマー基質の連続的縮合反応を触媒する酵素の総称であり、生成物の鎖長により分類され、これまでに10数種類が知られている。しかしこれら個々の酵素が如何にして生成物の鎖長を決定しているかについては全く不明である。そこで、今回、鎖長決定機構を解明するために、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素やファルネシル二リン酸合成酵素などのプレニルトランスフェラーゼ遺伝子にランダムに変異を導入し、In vivo検出系を用いて最終生成物の変化した変異体を作製し、解析を行った。ファルネシル二リン酸合成酵素にランダム変異を導入しゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を持つ変異体をリコペン生産による大腸菌の着色を指標にしたシステムを利用し探索したところ4種類の変異体を得ることができた。これら変異型酵素を解析したところいずれもゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性をIn vitroで示し、3つのアミノ酸が鎖長決定に重要な寄与をしていることが明らかになった。特に初めアスパラギン酸に富んだ領域の5残基上流に存在するチロシンが鎖長決定に直接的に寄与していることが判った。また、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素にランダム変異を導入した場合にも幾つかのより長鎖の生成物を与える変異体が得られこれらの解析から上記アミノ酸がゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の場合にも重要な寄与をしていることを明らかにした。