固定化複合酵素の二段階連続反応を利用したグルタチオンのワンポット合成に関する研究

固定化复合酶两步序贯反应一锅法合成谷胱甘肽的研究

• 批准号: 07750874
• 负责人: 後藤 猛
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Akita University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750874/
• 关键词: グルタチオン; γ-グルタミルトランスペプチダーゼ; アミノペプチダーゼM

医薬品として需要が大きいグルタチオン(L-γ-グルタミル-L-シルテニルグリシン)は、主に酵母菌を用いた発酵法により生産されているが、その生産効率は低い。一方で、グルタチオン合成酵素を利用した酵素的合成法も報告されているが、高エネルギー化合物ATPを必須とするなど、実用的ではない。本研究は、本来グルタチオンの加水分解酵素である膜酵素、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP)とアミノペプチダーゼM(APM)の可逆性に着目し、両酵素を利用したグルタチオンの新規な酵素的合成方法の開発を目的としたものである。まず始めに、両酵素の調製方法について検討した。腎臓絨毛膜はγ-GTPとAPMを共に有することから、酵素源として牛腎臓絨毛膜を使用した。遠心分離操作により調製した牛腎臓絨毛膜画分をコール酸で可溶化し、界面活性剤透析法により絨毛膜プロテオリポソームを再構成した。このプロテオリポソームを用いた酸素反応の見かけ上のMichaelis定数および最大反応速度を調べたところ、プロテオリポソーム再構成により両酵素の基質に対する親和性が増加して反応性が向上することが分かった。さらに、カラム充填型リアクターを用いてその安定性についても知見を得た。上記により得られた複合酵素系を用いて、グルタミン酸、システイン、グリシンからのグルタチオン合成を試み、逆相カラムHPLC、陽イオン交換カラムHPLC、セルロースTLCにより分析してグルタチオンが酵素的に合成できることを確認した。また、グルタチオン生成条件に関する検討も行ったところ、グルタミン酸の代わりにグルタミンを用いることにより生成量が約4倍に増加すること、最適pHは7〜7.5であることが分かった。さらに、この2段階連続反応の簡単なモデル化を行い、計算によりグルタチオンの生成の様子を説明できることが分かった。

Medical products need to be produced in large groups (L-γ-groups), but the main yeast is used in the fermentation method, and the production efficiency is low. A method of synthesizing enzymes by using enzymes is reported in this paper. This study aims to develop a new enzyme synthesis method for the reversible use of membrane enzyme, γ-GTP and APM (APM), which is a natural hydrolytic enzyme of the protein. The method of enzyme modulation is discussed in detail. The kidney chorionic membrane has γ-GTP and APM, and the enzyme source is used in the kidney chorionic membrane. In the process of telecentric separation, the chorionic membrane was solubilized by hydrochloric acid, and the chorionic membrane was reconstituted by dialysis. The affinity of the enzyme matrix increases when the enzyme matrix is reconstituted. In addition, the system can be used to fill in the stability of the system. The complex enzyme system described above was used for synthesis, and the synthesis of glucamine acid, sitonin, and glucamine from glucamine was tested. The synthesis of glucamine from glucamine was confirmed by analysis using reverse-phase HPLC, cationic exchange HPLC, and Cellos TLC. The optimum pH for the production of acid is 7 ~ 7.5, and the amount of acid produced is increased by about 4 times. This is a two-stage connection. It is simple and simple. It is easy to calculate. It is easy to generate.