放線菌インテグラーゼの特性と組み込み型ベクター化への利用開発に関する研究

放线菌整合酶的特性及其在整合矢量化中的应用研究

• 批准号: 07760090
• 负责人: 土居 克実
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760090/
• 关键词: 放線菌; プラスミド; 部位特異的組換え; 付着部位; インテグラーゼ; イグシジョナーゼ; 組込みベクター; タンパク質発現

放線菌Streptomyces azureusのプラスミドpSA1.1の染色体中の組込みに必須な遺伝子を含む1540bpの断片をクローニングし、本断片中に630bpの組込み遺伝子(int)、210bpの切出し遺伝子(xis),及び付着部位(att P)を同定した。本int遺伝子はSacchropolyspora erythraeaのプラスミドpSE211、pSE101やStreptococcus pneumoniaeのトランスポゾンTn1545、乳酸桿菌ファージphiLC3のインテグラーゼと高い相同性が認められた。また、xis遺伝子はpSE211やTn1545の他、Streptomyces ambofaciensのプラスミドpSAM2のイグシジョナーゼ等と相同性が認められた。更に、att Pの宿主染色体上の相同領域att Bを同定し、47bpにわたるコア領域が低G_+C含量であることを示した。これらの結果から、pSA1.1の染色体中への組込み機構を明らかにし、attP-int遺伝子を含む断片をpUC118ベクターにクローニングし、組込みベクターpINT7を構築した。次に、int遺伝子を含むpSA1.1の1156bp SalI断片をtacプロモーターを保持した発現ベクターpGEX-5X-1に挿入し、組換えプラスミドpEXP10を構築した。pEXP10を形質転換したE.coli JM109株を、IPTG誘導によりグルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質を発現させた。発現した融合タンパク質はSDS-PAGEにより分子量を測定し、約50kDaのGST-Int融合蛋白質であることを確認した。本融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製を行い、得られた標品をFactorXaによって切断した。精製したインテグラーゼとpSA1.1の各断片と反応させ、ゲル移動度シフトアッセイを行った結果、att P領域を含んだ断片のみに移動度の変化が認められ、インテグラーゼがatt P近傍のarmに結合してコア領域の切断・DNA鎖の再結合反応を触媒することが示唆された。

The genome of Streptomyces azureus pSA1.1 contains a fragment of 1540bp, a fragment of 630bp, a fragment of 210bp, and a fragment of 210bp. This int contains Sacchropolyspora erythroea, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus sp. pSE211, pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE211, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE211, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE211, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp. pSE101, Lactobacillus sp. pSE1545, Lactobacillus sp The identity of pSE211 and Tn1545, Streptomyces ambofaciens and pSAM2, etc. In addition, att P has the same region on the host chromosome, att B, and 47bp. The region has low G_+C content. As a result, pSA1.1 chromosome structure was constructed by pUC118 fragment, attP-int fragment and pINT7 fragment. The 1156bp SalI fragment of pSA1.1 was included in the construct of pGEX-5X-1. pEXP10 was transformed into E.coli JM109 strain, and the fusion protein was produced by IPTG induction. The molecular weight of the fusion protein was determined by SDS-PAGE, and the presence of a GST-Int fusion protein of approximately 50kDa was confirmed. This is the first time I've ever seen a product like this. Refine the fragment of pSA1.1, remove the fragment of pSA1.1

项目成果

K.Doi et al.: "Plasmid formation and its relation to the formation of spontaneously developing pocbs in Streptornyces azureus ATCC14921" J.Appl.Bacteriol.79. 237-243 (1995)

K.Doi 等人：“天蓝色链霉菌 ATCC14921 中的质粒形成及其与自发发育 pocb 形成的关系”J.Appl.Bacteriol.79。

土居 克実: "遺伝子ターゲッティングの基礎と応用" (株)コロナ社, 38 (1995)

Katsumi Doi：“基因打靶的基础和应用” Coronasha Co., Ltd.，38 (1995)

K.Doi et al.: "Relationship between Fermchtation Quality of Silage and Presence of Phages for Silage-Muking lactobocilli" Bull.Natl Grassl.51. 31-39 (1995)

K.Doi 等人：“青贮饲料发酵质量与青贮饲料发酵乳杆菌噬菌体存在之间的关系”Bull.Natl Grassl.51。

K.Doi et al.: "Transfer Function of Spi Gene in Plasmid pSA1.1 of Streptomyces azureus ATCC 14921" Actinomycetologica. 9. 44-48 (1995)

K.Doi 等人：“天青链霉菌 ATCC 14921 质粒 pSA1.1 中 Spi 基因的转移功能”放线菌。

K.Doi et al.: "Two Plasimds Related to Spontaneously Developing Pocks in Streptomyces laurentii" Biosci.Biotech.Biochem.59. 1040-1043 (1995)

K.Doi 等人：“劳伦链霉菌中与自发形成痘痕相关的两个质粒”Biosci.Biotech.Biochem.59。