GABA_B受容体機能に対するリン酸化反応の影響とその薬理学的意義の解析

磷酸化对GABA_B受体功能的影响及其药理意义分析

• 批准号: 07770072
• 负责人: 廣内 雅明
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770072/
• 关键词: GABA_B受容体; Gi蛋白質; アデニル酸シクラーゼ; 再構成

GABA_B受容体の機能を評価する方法として、再構成系による検討を試みた。そのために、バクロフェンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行い、GABA_B受容体を単離・精製した。さらに、GABA_B受容体の細胞内情報伝達系の一つであるcAMP生成系に関与する機能蛋白質系についても精製を行った。adenylyl cyclase(AC)はDEAE-Toyopearl及びToyopearl HW-55カラムを用いて精製した。また、GTP結合蛋白質は多種類のものが知られているが、その中でACに抑制的に作用するGiサブタイプだけを得ることを目的とした。すなわち、DEAE-Sephacel、Ultrogel AcA34カラムを用いて[^<35>S]GTP-γS結合活性を持つ分画を得た後、Mono Qカラムを用いたHPLCを繰り返すことにより精製を行った。この標品を種々のGTP結合蛋白質を認識する抗体で検討したところ、抗Goα抗体とは反応せず、抗Giα_<1-3>抗体及び抗Giα_<1-3>抗体に反応するものであった。従って、本標品は百日咳毒素(PTX)感受性GTP結合蛋白質のうち、Gi_1あるいはGi_2サブクラスに相当するものを含んでいると考えられる。このようにして得られたGABA_B受容体、Gi及びACの3種類の標品を人工リン脂質膜上に再構成し、受容体刺激に伴うcAMP生成に及ぼす影響を検討した。その結果、GABAの添加により、forskolin刺激下のcAMP生成は低下することが明らかとなった。この結果、膜レベルにおいて検討されてきたGABA_B受容体がAC活性を抑制的に調節しているという現象が、Giを介して直接的にcAMP生成系に作用することの分子機構を証明するものと考えられる。以上の結果より、本実験系はGABA_B受容体の機能を分子レベルで解析するうえで有効な手段になるものと考えられる。

Methods for evaluating the function of GABA_B receptor and its reconstruction system are discussed. The GABA_B receptor is isolated and refined. In addition, GABA_B receptor intracellular information transmission system is related to cAMP production system and functional protein system is refined. adenylcyclase (AC) is refined by DEAE-Toyopearl and Toyopearl HW-55. GTP binding proteins are known to be involved in a wide variety of activities, including the inhibition of GTP binding proteins. After <35>the analysis of GTP-γS binding activity, Mono Q was purified by HPLC. The target species GTP binding protein is recognized by antibodies, anti-Go alpha antibodies, anti-Gi alpha <1-3>antibodies, and anti-Gi alpha <1-3>antibodies This standard product contains pertussis toxin (PTX) sensitive GTP binding protein. The effects of GABA_B receptor, Gi and AC on the formation of artificial lipid membrane, receptor stimulation and cAMP production were investigated. As a result, the addition of GABA and the decrease of cAMP production under the stimulation of forskolin As a result, GABA_B receptor plays an important role in the regulation of AC activity. Gi plays an important role in the direct cAMP production system. The above results are based on the molecular analysis of the function of GABA_B receptor.