受容体遺伝子導入によるアクチビンの増殖抑制効果の研究

受体基因导入激活素生长抑制作用的研究

基本信息

批准号：
07770357
负责人：
真嶋浩聡
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770357/
关键词：
アクチビンA アクチビン受容体ヒト肝癌細胞 RB蛋白

项目摘要

アクチビン受容体にはI型、II型が存在する。受容体I,IB型cDNA、受容体II,IIB型cDNAを利用して発現ベクターを作製した。ヒト肝癌細胞株に発現ベクターを形質導入し、耐性薬剤を利用して単一のクローンを得た。ノザンブロッティングにより受容体のmRNAが発現していることを確認し、[^<125>I]アクチビンAを用いた結合実験により作られた蛋白が受容体として正しく機能していることを確認した。[^<125>I]アクチビンAが結合するためにはII型、またはI型+II型の発現が必要であり、I型のみでは結合しなかった。これらの細胞株を用いてアクチビンAによる増殖抑制効果を検討した。増殖抑制効果は細胞数、DNA量の経時的変化、[^3H]thymidineの取り込みを指標として測定した。しかしヒト肝癌細胞株PCL/PRF/5, Huh7, HLEの3株ともアクチビン受容体を発現させた後もアクチビンAによる増殖抑制効果は全くみられなかった。以上からアクチビンA不応性の原因は受容体以降のステップにあることが示された。アクチビンの細胞内の情報伝達機構はほとんどわかっていないが、TGF-βはサイクリン依存性キナーゼの活性を抑え、RB蛋白のリン酸化を抑制して増殖抑制作用を示すことがわかってきた。そこで形質導入したPCL/PRF/5細胞のRB蛋白のリン酸化の程度をアクチビンAの有無で検討したところ、アクチビンAによるRB蛋白のリン酸化の抑制は見られなかった。今回検討したヒト肝癌細胞株のアクチビンA不応性の原因は、受容体とRB蛋白の間のシグナルの異常にあると考えられた。

激活素受体是I型和II型。使用受体I和IB cDNA和受体II和IIB cDNA制备表达载体。用表达载体转导人肝癌细胞系，并使用抗性剂获得单个克隆。我们确认受体mRNA是通过北印迹表达的，并证实了使用[^<125> i]激活素A的结合实验产生的蛋白质，作为受体正常工作。 [^<125> i]激活素A结合需要II型或I型I+II的表达，而单独的I类型没有结合。使用这些细胞系，研究了激活素A的作用以抑制生长。使用细胞计数的变化，随时间的DNA量和[^3H]胸苷摄取作为指标来测量生长的抑制作用。然而，即使在激活素受体的表达后，所有三种人肝癌细胞系（PCL/PRF/5，HUH7和HLE）也没有生长抑制素A的生长抑制作用。从上面看，激活素A难治性的原因位于受体后的步骤中。尽管鲜为人知的激活素的细胞内信号传导机制，但已经发现TGF-β抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性并抑制RB蛋白的磷酸化，从而表现出增殖抑制作用。因此，当我们研究了通过或不存在激活素A的转导PCL/PRF/5细胞中Rb蛋白的磷酸化程度时，未发现通过激活素A抑制RB蛋白的磷酸化。我们在这里研究的人肝癌细胞系中的激活素A难治性的原因被认为是由于受体和RB蛋白之间的异常信号引起的。