ヒト血管内皮細胞におけるNO合成酵素遺伝子の発現とその調節メカニズムの解析

人血管内皮细胞NO合酶基因表达及其调控机制分析

• 批准号: 07770512
• 负责人: 宮原 馨
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kochi Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770512/
• 关键词: NO合成酵素; 血管内皮; Spl; 転写因子; プロモーター

ヒト血管内皮型の一酸化窒素(NO)合成酵素(eNOS)遺伝子の5′上流域にはTATA boxはなく、GC含量が高いハウスキーピングな遺伝子の特徴を有してる。この遺伝子の2.2kb上流域のプロモーター活性を血管内皮細胞を用いてCATアッセイにより解析してみると、-2200から-116までの領域においては、活性の変動がほとんどみられなかった。しかし、-97までしか含まない領域では、活性は急激に低下し、ベイサルレベルであった。この領域を含む塩基配列と血管内皮細胞からの核抽出物でゲルシフトアッセイを行うと三本の特異的なバンドが検出された。これらのバンドは、正常な配列のDNAにより競合するが、Spl結合配列が変異したDNAでは競合しないことから、このSpl結合配列を認識する蛋白質因子が存在することが解った。抗Spl抗体の存在下でゲルシフトアッセイを行うと、三本のうちもっとも遅いバンドが消失し、スーパーシフトしたバンドが検出された。さらに、このSpl結合配列が変異した上流領域は、CATアッセイの結果から、プロモーター活性が消失することが判明した。これらの結果から、Spl結合配列を含む100bp上流領域が、コア・プロモーターとして働いていることが解明された。一方、もう一つのタイプの誘導されるNO合成酵素(iNOS)遺伝子の発現はヒトの組織においては、血管平滑筋などにおいて確認されている。ヒト血管内皮細胞で種々の薬物を投与し調べた結果、ILlβとIFNγとが共存するときiNOSのmRNAが検出され、内皮細胞でも誘導され発現することが判明した。このiNOS遺伝子の転写調節を解析するために、マクロファージ型のNO合成酵素遺伝子をヒトゲノムライブラリーより単離した。上流約3800bpにわたる領域の塩基配列を決定したところ、-1500と-2300には100bpのダイレクト反復配列が存在していた。CATアッセイによって、-406まではサイトカインで誘導がかかりプロモーター活性は上昇した。このことより、この上流域が、サイトカインによる誘導に必須であることが解った。

ヒ ト endothelial type の a acidification smothering element (NO) synthesis enzyme (eNOS) posthumous son 伝 の in the upper reaches of the 5 'に は TATA box は な く, high GC content が い ハ ウ ス キ ー ピ ン グ な heritage 伝 ithream by の 徴 を have し て る. こ の heritage 伝 の son in the upper reaches of the 2.2 KB の プ ロ モ ー タ ー active を を vascular endothelial cells with い て CAT ア ッ セ イ に よ り parsing し て み る と, - 2200 か ら - 116 ま で の field に お い て は, active の - move が ほ と ん ど み ら れ な か っ た. The まな of the <s:1>, -97まで of the まで contains まな of the で of the まな domain, で of the であった of activity, に of the に of low activity, ベ サ サ レベ レベ レベ であった. を こ の field containing む salt base with column と endothelial cells か ら の nuclear extract で ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ を line う と three の specific な バ ン ド が 検 out さ れ た. こ れ ら の バ ン ド は, normal な match column の DNA に よ り co-opetition す る が, Spl combined with column が - different し た DNA で は co-opetition し な い こ と か ら, こ の Spl combined with column を know す る protein factors が す る こ と が solution っ た. Resistance to the presence of Spl antibody の で ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ を line う と, three の う ち も っ と も 遅 い バ ン ド が disappear し, ス ー パ ー シ フ ト し た バ ン ド が 検 out さ れ た. さ ら に, こ の Spl combined with column が - different し た は upper field, CAT ア ッ セ イ の results か ら, プ ロ モ ー タ が ー disappeared す る こ と が.at し た. こ れ ら の results か ら を, Spl combined with column contains む 100 bp upstream areas が, コ ア · プ ロ モ ー タ ー と し て 働 い て い る こ と が interpret さ れ た. A side, も う つ の タ イ プ の induced さ れ る NO synthetase (iNOS) heritage 伝 son の 発 now は ヒ ト の organization に お い て は, vascular smooth muscle な ど に お い て confirm さ れ て い る. ヒ ト で kind of vascular endothelial cells 々 の 薬 を throw objects with し adjustable べ た results, ILl beta と IFN gamma と が coexistence す る と き iNOS の mRNA が 検 out さ れ, endothelial cells, で も induced さ れ 発 now す る こ と が.at し た. こ の iNOS posthumous son 伝 の planning write adjust を parsing す る た め に, マ ク ロ フ ァ ー ジ type の NO synthetase heritage 伝 son を ヒ ト ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー よ り 単 from し た. High of about 3800 bp に わ た る field の salt base with column を decided し た と こ に と ろ, - 1500-2300 100 bp の は ダ イ レ ク ト repeatedly with column が exist し て い た. CAT ア ッ セ イ に よ っ て, - 406 ま で は サ イ ト カ イ ン で induced が か か り プ ロ モ ー タ ー active は rise し た. こ の こ と よ り, こ の basin が, サ イ ト カ イ ン に よ る induced に must で あ る こ と が solution っ た.

项目成果

Wariishi,S.et al.: "A Spl Binding Site in the GC-Rich Region Is Essential for a Core Promoter Activity of the Human Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene." Biochem.Biophys.Res.Commun.216. 729-735 (1995)

Wariishi,S.et al.：“富含 GC 区域的 Spl 结合位点对于人内皮一氧化氮合酶基因的核心启动子活性至关重要。”

Miyahara,K.et al.: "Cloning and Structural Characterization of the Human Enoothelial Nitric-Oxide-Synthase Gene." Eur.J.Biochem.223. 719-726 (1994)

Miyahara,K.et al.：“人类内皮一氧化氮合酶基因的克隆和结构表征。”