先天性アンチトロンビンIII欠損症の遺伝子解析

先天性血栓症発症要因として重視される,先天性アンチトロンビン欠損症20家系を対象に末梢血白血球より,genomic DNAを抽出し,(1)RFLP:Pst-1,EcoR-1,Hind-IIIによるdigestionによりATc-DNA probeを用いてsouthern hybridizationを施行.partialあるいはwhole gene deletion等を検討.(2)PCR:AT遺伝子の各exonを5'末端をbiotinで標識したreverse primerおよびbiotin非標識foward primerによりPCR法によりflanking領域を含めて増幅.(3)Heteroduplex analysis:各PCR産物をheat reaction(95℃,3minutes)後,徐々に(20・30minutes)coolingし,heteroduplexを形成.Hydrolink Gel Solutionを用いたelectrophoresisによりmutant strandの有無を検討.(4)Direct Sequencing:PCR産物をstreptavidinで被覆されたMagnetic beadsを用いて固相にて回収後,アルカリ変性にてsenseおよびantisenseの一本鎖DNAをそれぞれ分離,調整.各一本鎖DNAを鋳型としてSequenase Ver.2.0を用いたdirect sequencing法にて塩基配列を決定.No.1(typeI);exon5,codon 362(TAT to T,2bp deletion,heterozygote).No.2(type I);exon4,codon 310(GAA to GA,1bp deletion,heterozygote).No.3(type II,AT-Osaka1);exon6,codon 407 CCT(Pro)to ACT(Thr)missense mutation,heterozygote.No.4(type II,AT-Osaka 2);exon6,codon 393 CGT(Arg)to CAT(His)missense mutation,heterozygote.以上に加え,No.5(type I);exon3A,codon 129 CGT(Arg)to TGA(stop codon)nonsense mutation,heterozygote.No.6(type I);exon4,codon 260 TAT(Tyr)to TAA(stop codon)nonsense mutation,heterozygoteを検出した.これらの疾患発症に関わる分子生物学的背景が明らかにされた.

先天性血栓症発症要因として重視される,先天性アンチトロンビン欠損症20家系を対象に末梢血白血球より,genomic DNAを抽出し,(1)RFLP:Pst-1,EcoR-1,Hind-IIIによるdigestionによりATc-DNA probeを用いてsouthern hybridizationを施行.partialあるいはwhole gene deletion等を検討.(2)PCR:AT遺伝子の各exonを5'末端をbiotinで標識したreverse primerおよびbiotin非標識foward primerによりPCR法によりflanking領域を含めて増幅.(3)Heteroduplex analysis:各PCR産物をheat reaction(95℃,3minutes)後,徐々に(20・30minutes)coolingし,heteroduplexを形成.Hydrolink Gel Solutionを用いたelectrophoresisによりmutant strandの有無を検討.(4)Direct Sequencing:PCR産物をstreptavidinで被覆されたMagnetic beadsを用いて固相にて回収後,アルカリ変性にてsenseおよびantisenseの一本鎖DNAをそれぞれ分離,調整.各一本鎖DNAを鋳型としてSequenase Ver.2.0を用いたdirect sequencing法にて塩基配列を決定.No.1(typeI);exon5,codon 362(TAT to T,2bp deletion,heterozygote).No.2(type I);exon4,codon 310(GAA to GA,1bp deletion,heterozygote).No.3(type II,AT-Osaka1);exon6,codon 407 CCT(Pro)to ACT(Thr)missense mutation,heterozygote.No.4(type II,AT-Osaka 2);exon6,codon 393 CGT(Arg)to CAT(His)missense mutation,heterozygote.以上に加え,No.5(type I);exon3A,codon 129 CGT(Arg)to TGA(stop codon)nonsense mutation,heterozygote.No.6(type I);exon4,codon 260 TAT(Tyr)to TAA(stop codon)nonsense mutation,heterozygoteを検出した.これらの疾患発症に関わる分子生物学的背景が明らかにされた.