悪性脳腫瘍のリボザイムを用いた薬剤耐性克服に関する分子生物学的研究

利用核酶克服恶性脑肿瘤耐药性的分子生物学研究

• 批准号: 07771079
• 负责人: 渡辺 克夫
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Akita University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07771079/
• 关键词: DNA損傷修復; MGMT; リボザイム; ニトロソウレア剤; 分子生物学; 薬剤耐性; 脳腫瘍; 化学療法

脳腫瘍細胞のニトロソウレア剤に対する耐性の主因をなす0^6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT)の遺伝子発現を制御する目的で,mRNAの切断作用を有するリボザイムを作成した.対象とした遺伝子配列は,MGMTの遺伝子転写開始部位部位,第4エクソン開始部位,MGMT活性の中心をなす145番目のシステイン塩基近傍の計3カ所であり,それぞれに対する特異的配列を持つリボザイムを50〜52merのサイズで設計し,pBlueScript II のMCS(EcoR I site)に導入して in vitro transcription を行い,Rz1,Rz2,Rz3を作成した.Cell free system の実験系として,MGMT遺伝子の cDNA を組み込んだ ρKT107(Dr.Mitra より譲渡)から in vitro taranscription を行い合成したMGMT mRNA(^<32>P標識)をMgcl_2存在下で,同一モル数のRZ1,Rz2,Rz3のそれぞれと反応させたところ,37℃の条件下では120minを経過しても明瞭な切断反応は観察されなかったが,温度を60℃まで上昇させた条件下で反応させると,Rz1,Rz2,Rz3ともにMGMT mRNAに対する特異的切断反応を示し,いずれのリボザイムも反応時間に応じて効率が上昇した.現在,各リボザイム間の切断効率の差を各種条件(温度,濃度,時間,等)を変えて検討している.また,生理的条件である37℃で反応するリボザイムの設計を新たに行っており,最も切断効率の高いリボザイムが得られた段階で,MGMTが高発現している腫瘍細胞(SF-188,HeLa S3 等ニトロソウレア剤に耐性を示す細胞)に導入し,培養細胞系におけるHGMT遺伝子発現抑制によるニトロソウレア剤耐性克服の可能性について検討する予定である.

To control the expression of 6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) gene, a key factor in the resistance of tumor cells to apoptosis,mRNA cleavage has been established. The sequence of MGMT gene is the beginning of MGMT gene sequence, the center of MGMT activity, the center Rz1, Rz2, Rz3 were constructed in vitro transcription (EcoR I site).Cell free system was established in vitro transcription (Dr. Mitra). MGMT cDNA was assembled in vitro transcription (Dr. Mitra<32>). The same number of RZ1, Rz2, Rz3 in the opposite direction, under the condition of 37 ℃ for 120 minutes, the temperature increased at 60℃ for the opposite direction, Rz1, Rz2, Rz3 and MGMT mRNA in the opposite direction, the opposite direction, the middle of the opposite direction time increased. Now, the difference in the cutting efficiency between the various types of lights is discussed under various conditions (temperature, concentration, time, etc.). Under physiological conditions at 37℃,MGMT was found to be highly active in tumor cells.(SF-188,HeLa S3, etc.) was introduced into cultured cell lines to inhibit HGMT gene development.