Analysis of the intracellular second messenger pathway in the intestinal epithelial cell

平成4-5年度交付の国際学術共同研究の遂行により、神経ペプチドが消化管粘膜上皮細胞からの水分泌を誘発し、その作用はそれぞれのペプチドの前処置により著明に増強されることを観察した。これらペプチドは細胞内情報伝達系としてCa2+及びc-AMPなどを利用すると考えられるが、現在その作用機構については明らかではない。平成8年度は、substance Pによる細胞内Ca2+濃度上昇に関与していると考えられる情報伝達系の解析を共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。その結果、substance Pの刺激により細胞内Ca2+濃度は容量依存的に増加したが、この上昇は一過性であった。さらに、substance P受容体に特異的な阻害剤の使用により、この細胞内Ca2+濃度上昇は有意に抑制した。細胞外Ca2+の除去によっても、substance Pによる細胞内Ca2+濃度上昇は抑制されたが消失はしなかった。さらに、細胞内Ca2+貯蔵部位のCa2+を枯渇させるthapsigarginの前処置によってもsubstance Pによる細胞内Ca2+濃度の上昇は、完全には抑制されなかった。しかしながら、thapsigarginの前処置と同時に細胞外からCa2+を除去すると、substance Pによる細胞内Ca2+濃度の上昇は著しく抑制された。さらに、Ussing chamberを用いた実験で、基底膜側(漿膜側)のCa2+の除去により、substance Pによるクロライドイオン分泌は完全に消失した。以上の結果から、粘膜上皮におけるsubstance Pによるクロライドイオン分泌機序には、小胞体からのCa2+の放出と同時に、細胞外からのCa2+の流入の関与が強く示唆され、特に基底膜からのCa2+の流入が重要な役割を果たしていることが示唆された。平成8年度の実験結果から、漿膜側からのCa2+の流入が粘膜上皮でのクロライドイオン分泌に必要不可欠であることが明らかとなった。そこで、平成9年度は、漿膜側のCa2+の重要性についてさらに詳細な検討を加えた。まず、細胞外からのCa2+流入にどのようなcalcium channelが関与しているかを明らかにするため、各種calcium channel阻害剤を用いて検討した。calcium channel阻害剤には電位依存性のL型とT型の阻害剤を使用し、L型チャネルの阻害剤にはnifedipineとverapamil、T型のチャネルの阻害剤にはoctanolとflunarizineを用いた。その結果、L型、T型チャネル阻害剤の前処置によってもSubstance Pによる細胞内Ca2+濃度の上昇には変化が観察されなかった。今後はさらにL型、T型以外の電位依存性のカルシウムチャネル及び電位非依存性カルシウムチャネルについての検討が必要である。

平成4-5年度交付の国際学術共同研究の遂行により、神経ペプチドが消化管粘膜上皮細胞からの水分泌を誘発し、その作用はそれぞれのペプチドの前処置により著明に増強されることを観察した。これらペプチドは細胞内情報伝達系としてCa2+及びc-AMPなどを利用すると考えられるが、現在その作用機構については明らかではない。平成8年度は、substance Pによる細胞内Ca2+濃度上昇に関与していると考えられる情報伝達系の解析を共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。その結果、substance Pの刺激により細胞内Ca2+濃度は容量依存的に増加したが、この上昇は一過性であった。さらに、substance P受容体に特異的な阻害剤の使用により、この細胞内Ca2+濃度上昇は有意に抑制した。細胞外Ca2+の除去によっても、substance Pによる細胞内Ca2+濃度上昇は抑制されたが消失はしなかった。さらに、細胞内Ca2+貯蔵部位のCa2+を枯渇させるthapsigarginの前処置によってもsubstance Pによる細胞内Ca2+濃度の上昇は、完全には抑制されなかった。しかしながら、thapsigarginの前処置と同時に細胞外からCa2+を除去すると、substance Pによる細胞内Ca2+濃度の上昇は著しく抑制された。さらに、Ussing chamberを用いた実験で、基底膜側(漿膜側)のCa2+の除去により、substance Pによるクロライドイオン分泌は完全に消失した。以上の結果から、粘膜上皮におけるsubstance Pによるクロライドイオン分泌機序には、小胞体からのCa2+の放出と同時に、細胞外からのCa2+の流入の関与が強く示唆され、特に基底膜からのCa2+の流入が重要な役割を果たしていることが示唆された。平成8年度の実験結果から、漿膜側からのCa2+の流入が粘膜上皮でのクロライドイオン分泌に必要不可欠であることが明らかとなった。そこで、平成9年度は、漿膜側のCa2+の重要性についてさらに詳細な検討を加えた。まず、細胞外からのCa2+流入にどのようなcalcium channelが関与しているかを明らかにするため、各種calcium channel阻害剤を用いて検討した。calcium channel阻害剤には電位依存性のL型とT型の阻害剤を使用し、L型チャネルの阻害剤にはnifedipineとverapamil、T型のチャネルの阻害剤にはoctanolとflunarizineを用いた。その結果、L型、T型チャネル阻害剤の前処置によってもSubstance Pによる細胞内Ca2+濃度の上昇には変化が観察されなかった。今後はさらにL型、T型以外の電位依存性のカルシウムチャネル及び電位非依存性カルシウムチャネルについての検討が必要である。