変異体の選択的破壊によるミトコンドリアゲノム制御の基礎研究

通过选择性破坏突变体调控线粒体基因组的基础研究

• 批准号: 08457047
• 负责人: 田中 雅嗣
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Institute of Applied Biochemistry (1997)Nagoya University (1996)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08457047/
• 关键词: ミトコンドリア脳筋症; F_0F_1-ATPase; 制限酵素; シグナルペプチド; チトクロームオキシダーゼ; ミトコンドリア; 遺伝子治療; 緑色蛍光蛋白質; ミトコンドリア遺伝子; 融合蛋白質; Leigh脳症; ミトコンドリア病

本研究では、ミトコンドリア脳筋症・心筋証において見いだされるミトコンドリアDNAの塩基番号8993のT*G塩基転換を特異的に除去することを目指した。この変異によってF_0F_1-ATPaseのATP6サブユニットにLeu*Arg置換が生じ、そのプロトンチャンネル機能に異常が生じATP合成が低下する。この変異によって制限酵素SmaIの切断部位が出現する。正常型mtDNAにはSmaIの認識配列が存在しないため、変異型mtDNAのみを特異的に破壊することが可能である。制限酵素SmaIをミトコンドリアのマトリックス酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼのシグナルペプチドとの融合タンパク(OTC-SmaI)として合成させ、ミトコンドリア内へ選択的に輸送させた。OTC-SmaIのミトコンドリアへの輸送を確認するために緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質を細胞内に発現させたが、ミトコンドリアの蛍光は弱く、多くの細胞が剥離し、導入効率が低かった。発見したOTC-SmaIがミトコンドリアから核へ漏出し、核DNAを破壊するために致死的となると推定された。制限酵素EcoRIに、より強力なシグナル活性を有するCOXIV(チトクロームオキシダーゼの第4サブユニット)のシグナルを付けた融合蛋白(COXIV-EcoRI)をgalactoseプロモータの制御の下で酵母で発見させた。その発現により、ミトコンドリアDNAが消失したが、細胞毒性も強いことが明らかになった。そこで安全装置としてCOXIV-EcoRIを発現するプラスミド自身にEcoRIによる切断部位を導入した。これによって、核にEcoRIが到達した時には、プラスミド自身がEcoRIによって破壊され、COXIV-EcoRIの発現を停止させることによって、核DNAの破壊を防止できた。ミトコンドリアへの移入活性の強いシグナルの選択と発現のON/OFF制御が重要であると結論された。

This study is aimed at removing the specific T*G gene mutation in the DNA of patients with heart disease. The ATP synthesis of F_0F_1-ATPase was decreased due to Leu*Arg substitution and abnormal ATP synthesis. The cleavage site of SmaI, a restriction enzyme, appears. The normal mtDNA sequence may exist, but the variant mtDNA sequence may exist. The fusion protein (OTC-SmaI) is selected from the group consisting of the enzyme inhibitor SmaI and the enzyme inhibitor SmaI. OTC-SmaI fusion protein (GFP) is found in cells, but its fluorescence is weak, and many cells are isolated and introduced at low efficiency. It is expected that the nuclear DNA will leak out and be destroyed. The enzyme EcoRI, a potent enzyme, has been identified as COXIV(the fourth enzyme), which is a fusion protein (COXIV-EcoRI) that controls galactose production. The DNA of the virus disappeared, and the cytotoxicity was strong. The safety device COXIV-EcoRI is introduced into the site where EcoRI is cut off. When EcoRI arrives, the virus itself is detected, and COXIV-EcoRI production is stopped. The conclusion is that it is important to select and control ON/OFF of the transition activity of the switch.

项目成果

Tanaka M: "Automated sequencing of mitochondrial DNA." Methods Enzymol.264. 407-421 (1996)

Tanaka M：“线粒体 DNA 的自动测序。”

Morikawa S: "Increases mitochondrial damage by lipid peroxidation in trophoblast cells of preeclamptic placentas." Biochem.Mol.Biol.Int.41. 767-775 (1997)

Morikawa S：“通过先兆子痫胎盘滋养层细胞中的脂质过氧化增加线粒体损伤。”

Nakamura N: "Specific detection of deleted mitochondrial DNA by in situ hybridization using a chimera probe." Biochim.Biophys.Acta. 1308. 215-221 (1996)

Nakamura N：“使用嵌合探针通过原位杂交特异性检测缺失的线粒体 DNA。”

Islam MM: "Primary structure of the Smallest(6.4-kDa)subunit of human and bovine ubiquinol-cytochrome c reductase deduced from cDNA sequences." Biochem.Mol.Biol.Int.41. 1109-1119 (1997)

Islam MM：“从 cDNA 序列推导出的人类和牛泛醇细胞色素 c 还原酶最小 (6.4-kDa) 亚基的一级结构。”

Tanaka M: "Mitochondrial genotype associated with longevity" Lancet. 351. 185-186 (1998)

田中 M：“与长寿相关的线粒体基因型”《柳叶刀》。