変異体の選択的破壊によるミトコンドリアゲノム制御の基礎研究

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本研究では、ミトコンドリア脳筋症・心筋証において見いだされるミトコンドリアDNAの塩基番号8993のT*G塩基転換を特異的に除去することを目指した。この変異によってF_0F_1-ATPaseのATP6サブユニットにLeu*Arg置換が生じ、そのプロトンチャンネル機能に異常が生じATP合成が低下する。この変異によって制限酵素SmaIの切断部位が出現する。正常型mtDNAにはSmaIの認識配列が存在しないため、変異型mtDNAのみを特異的に破壊することが可能である。制限酵素SmaIをミトコンドリアのマトリックス酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼのシグナルペプチドとの融合タンパク(OTC-SmaI)として合成させ、ミトコンドリア内へ選択的に輸送させた。OTC-SmaIのミトコンドリアへの輸送を確認するために緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質を細胞内に発現させたが、ミトコンドリアの蛍光は弱く、多くの細胞が剥離し、導入効率が低かった。発見したOTC-SmaIがミトコンドリアから核へ漏出し、核DNAを破壊するために致死的となると推定された。制限酵素EcoRIに、より強力なシグナル活性を有するCOXIV(チトクロームオキシダーゼの第4サブユニット)のシグナルを付けた融合蛋白(COXIV-EcoRI)をgalactoseプロモータの制御の下で酵母で発見させた。その発現により、ミトコンドリアDNAが消失したが、細胞毒性も強いことが明らかになった。そこで安全装置としてCOXIV-EcoRIを発現するプラスミド自身にEcoRIによる切断部位を導入した。これによって、核にEcoRIが到達した時には、プラスミド自身がEcoRIによって破壊され、COXIV-EcoRIの発現を停止させることによって、核DNAの破壊を防止できた。ミトコンドリアへの移入活性の強いシグナルの選択と発現のON/OFF制御が重要であると結論された。