gus-遺伝子導入根粒菌を用いたダイズ根粒形成機構の解析

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大腸菌のgus遺伝子と抗生物質耐性遺伝子を導入した根粒菌を、土壌中における根粒菌の生態やダイズ根粒形成機構の解析に利用するための方法を種々検討し、ダイズ栽培根箱実験でgus根粒菌の挙動を実際に調査した。まず、gus活性測定のために最も広く利用されている基質、X-Gluc.を用いて、gus菌の検出と菌数の測定法を検討した。根粒切片をX-Gluc.とSDSを含む溶液に数日間漬けることにより、gus菌を接種したダイズ根粒の感染域のみが青色に染まり、gus菌感染の有無が判定できた。次に、gus代謝産物の菌体内集積量から土壌中の菌数を推定する方法を確立した。抗生物質を含む水溶液にN,Nジメチルホルムアミドに溶解したX-Gluc.を加え、gus菌を含む土壌を30℃で4日間培養した。gus菌体内に集積した青色色素を液体フェノールで抽出して、その吸光度から菌数を測定した。培養期間中の菌の増殖は、N,Nジメチルホルムアミドの静菌効果と青色色素集積により抑制された。本測定法を用いて、5種類の土壌を詰めた根箱土壌中でのgus菌の移動と増殖、根粒形成について追跡した。どの土壌でも菌の移動が認められた。接種菌の増殖率は、100-1000倍と土壌により異なった。土着根粒菌が多い土壌では接種菌増殖率が高いにも係わらず、形成した根粒は土着菌によるものが多かった。X-Gluc.以外の基質を用いて測定方法を検討したところ、根粒のgus菌感染の判定には、X-Gluc.より蛍光基質である4-MUGを基質に用いた方が約15分と短時間で判定でき、適していた。さらに別の基質であるpNPGを用いることにより、感度が良く、約30分程度でgus活性の測定が可能であった。pNPG溶液に、SDSとエタノールを添加することにより、土壌の存在による活性の変化を抑えることができ、更に高感度測定が可能であった。gus菌の持つgus遺伝子を菌体から抽出してPCRで増幅し、検出する方法を検討したところ、純粋培養菌では、gus遺伝子の増幅に成功したが、土壌を含む試料では妨害が起こり検出できなかった。