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ホヤ胚細胞初期神経分化過程のギャップ結合-GFP融合蛋白発現による解析

利用间隙连接-GFP融合蛋白表达分析海鞘胚胎细胞早期神经分化过程

基本信息

批准号：
08670066
负责人：
高橋國太郎
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Meiji Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

胚の発生・分化には数々の細胞間相互作用が必要であり、初期胚細胞間に存在し分子量1.7kD以下の物質を透過させるギャップ結合はそうした相互作用を担う一形式であると考えられている。しかし、いまだ明確な証明は得られていない。本研究計画では、(1)ホヤ初期胚より分離した二細胞誘導系の各発生段階で、すでに報告したように蛍光色素を用いて二細胞間のギャップ結合の変動を定量する。(2)Connexin mRNAを注入して、対照標本のギャップ結合消失時期以後に強制的に発現する。このときConnexin遺伝子にGFP(green fluorescence protein)遺伝子を接続してmRNAを作製し、蛍光測光でconnexinの細胞間接着域への出現を定量する。ことを目的として研究をおこなった。外来性GJをホヤ胚細胞で可視的に発現させるために、ラットConnexin 32-EGFP融合蛋白cDNAを調製、そのcRNAをin vitroで作成した。アカボヤ受精胚は9°C海水中で培養し、8細胞胚期に卵膜を取り除き予定神経および脊索割球とからなる2細胞系を作製し、サイトカラシンBで分割阻止処理後その予定神経割球にConnexin 32-EGFP融合蛋白cRNAを顕微鏡下で注入した。注入後出現したEGFP蛍光をcCCDで計測して融合蛋白の生成を確認した。一方神経誘導後、内因性GJが消失したと考えられる発生30時間以降の同細胞系予定神経割球にLYを注入し、その色素透過性から外来性GJ蛋白の機能の発現を確認した。発生後20〜25時間の神経胚期にこのEGFP融合蛋白のGJを強制発現させると、GJの消失が遅延しそれに対応してNaスパイク出現時期も遅延した。このことから対照2細胞系では内因性GJの消失が予定神経割球の神経形質発現時期を制御しているものと考えられる。

The intercellular interaction of embryo differentiation is very important, and the molecular weight of the early embryo is below the molecular weight of 1.7kD. The molecular weight of embryonic differentiation is lower than that of molecular weight. Please make sure that it is clear and clear that you will get a lot of attention. In this study, we planned that: (1) the embryos in the early stage of embryo isolation were isolated from each segment of the two cell lines and reported that the phosphopigments were quantified by the combination of two-phase intercellular chromatography combined with kinetic assay. (2) the Connexin mRNA device is injected into the device, and the license is forcibly detected by combining the vanishing period in accordance with this label. The Connexin sub-GFP (green fluorescence protein) sub-unit is connected to the mRNA sub-unit, and the photometric connexin cell is connected to the domain where the quantitative measurement is detected. The purpose of this study is to study the subject matter. Exotic GJ germ cells that can be seen are made of cDNA genes, Connexin 32-EGFP fusion proteins, cRNA cells and so on. The fertilized embryos were cultured in 9 °C sea water, and the egg membranes were removed from the embryo stage at 9 °C, and the cell lines were divided to prevent the injection of Connexin 32-EGFP fusion protein cRNA. After injection, it was found that the fusion protein was generated by EGFP photoperiod cCCD assay. After the treatment of one side of the brain, the internal cause of GJ disappeared after 30 days of birth, the homologous cell line was predetermined to cut the ball, LY was injected, and the exogenous GJ protein machine was able to confirm the effect. During 20-25 hours after birth, the EGFP fusion protein, GJ, and GJ disappeared, and the detection time was delayed. In the light of the fact that the internal cause of the GJ disappears in the 2-year cell line, it is determined that the spirit of cutting the ball is in the form of the current system to control the system.