抗腫瘍単鎖抗体の作製とその臨床応用のための基礎的検討

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ヒトグリオブラスーマの一部の症例ではEGFR(Epidermal growth factor)遺伝子の一部欠損が認められる。この変異遺伝子により産生される遺伝子産物を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを既に樹立しており、抗体遺伝子を単離し、組み換え型単鎖抗体の作製を試みた。変異EGFRに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞より得られたRNAを用い、RT-PCR法により、H鎖、L鎖それぞれの超過変領域を含む抗原結合部をコードする遺伝子の単離を行った。抗体分子は(His)6Tag・L鎖・リンカー(15アミノ酸) ・H鎖の順に配置し、発現させた。産生された蛋白をSDS-PAGE、並びに(His)6Tagを標的としたWestern blotting法により抗体分子の確認を行い、その結果アミノ酸配列より予想される分子量約29kDaに一致した抗体のbandを確認した。大腸菌からはinclusion bodyとして抗体蛋白を得、refold後、本抗体に付加したHis Tagを利用して抗体を精製した。得られた抗体の活性を ELISA法で検討した結果、scFvは蛋白濃度あたり親抗体分子のl/5の抗体価を持っていることを明らかにした。次いで本抗体のnativeな抗原に対する反応性を変異EGFR遺伝子導入細胞及びwild typeのEGFRを発現するヒト由来扁平上皮癌株を対象としてMHA法により検査したところ、親抗体と同様に変異EGFR遺伝子導入細胞にのみ陽性反応を得、変異遺伝子産物に対する反応性を確認した。さらに本抗体による免疫染色も施行し、本遺伝子異常を示すヒトグリオブラストーマ症例の腫瘍組織の染色陽性を認めている.