NMRを用いたタンパク質分子に内在するダイナミックスと機能発現の研究

使用 NMR 研究蛋白质分子固有的动力学和功能表达

• 批准号: 10157204
• 负责人: 高橋 栄夫
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10157204/
• 关键词: Fv; NMR; 抗原結合部位; 構造多形; 両親媒性

我々は抗ダンシル抗体を酵素消化することにより得られるFvフラグメントを用いて,抗原認識機構の高次構造解析を行ってきた.昨年までのNMR,および速度論的手法を中心とする解析により,抗ダンシルFvの抗原結合部位を形成しているH3ループは,ハプテン非存在下において2種類のコンホメーションをとり,16(s^<-1>)の平均交換速度で移り変わっているが,ハプテン存在下では1種類のコンホメーションに収束することを明らかにしてきた.本年度は,抗原結合部位の示す動的構造と機能の相関について,より深い理解を得るために,抗ダンシルFvの大腸菌発現系の構築・部位特異変異体の作成を行い,それらの安定同位体標識NMRおよび蛍光測定法による解析を進めた.抗ダンシル抗体産生ハイブリドーマからRT-PCR法によりV_H,V_Lドメインをそれぞれコードする遺伝子を合成した.その遺伝子を個別に発現用ベクターに組み込み大腸菌発現系を構築し,V_H,V_Lを封入体として得た.次いでこれらの封入体蛋白質を変性剤存在下で等量混合し,段階的に変性剤濃度を低下させることにより,Fvを再構成した.その結果,V_H,V_Lドメイン各々1Lの培養から約3mgのへテロダイマーFvが得られた.また,ハプテンの認識に主要な役割を果たすH3ループに存在するTyr残基の部位特異変異体を作成した.蛍光測定により,得られたリコンビナントFv(WT)は,酵素消化により得られたFvと同様の結合能を有することが判明した.また,H鎖Y96F変異体(Y96F)の結合定数は,WTと比較し1/5に低下していた.Y96FのNMR解析の結果,WTで観測されていた2種類のコンホメーションに対応するNMRシグナルが,Y96Fでは観測されなかった.したがって,Tyr96の両親媒性が,抗原結合部位に存在する構造多形現象および結合能に関与していることが示唆された.

I 々 は resistance ダ ン シ を ル antibody enzyme digestion す る こ と に よ り have ら れ る Fv フ ラ グ メ ン ト を with い て, antigen institutions の high times tectonic line analytical を っ て き た. Yesterday in ま で の NMR, お よ び speed theory of を center と す る parsing に よ り, anti ダ ン シ ル Fv の antigen binding site を form し て い る H3 ル ー プ は, ハ プ テ ン the presence of に お い て 2 kinds の コ ン ホ メ ー シ ョ ン を と り, 16 (s ^ < - > 1) moving average exchange rate で の り - わ っ て い る が, ハ プ テ ン exist Under で は 1 species の コ ン ホ メ ー シ ョ ン に 収 beam す る こ と を Ming ら か に し て き た. の は this year, the antigen parts shown す dynamic function of tectonic と の phase masato に つ い て, よ り deeper understanding を い have る た め に, anti ダ ン シ ル Fv の coliform 発 now is の building, site specific - variant の を い, consummate そ れ ら の stable isotopic body logo NMR お よ び 蛍 light measurement に よ る parsing を into め た. Anti ダ ン シ ル antibodies ハ イ ブ リ ド ー マ か ら rt-pcr method に よ り V_H, V_L ド メ イ ン を そ れ ぞ れ コ ー ド す る heritage 伝 son を synthetic し た. そ の heritage 伝 son を individual に 発 current ベ ク タ ー に group み 込 み coliform 発 now を build し, V_H, V_L を seal in body と し て た. Time い で こ れ ら の を seal in body protein - sexual tonic で amount in the presence of mixed し Duan Jie に of low concentration - sexual tonic を さ せ る こ と に よ り, Fv を reconstitution し た. そ の results, V_H, V_L ド メ イ ン 々 1 l の cultivate か ら about 3 mg の へ テ ロ ダ イ マ ー Fv が must ら れ た. ま た, ハ プ テ ン の know に main な "を cut fruit Youdaoplaceholder0 H3 たす プに プに present するTyr residue <s:1> site-specific variant を to make た. 蛍 light に よ り, ら れ た リ コ ン ビ ナ ン ト Fv (WT) は, enzyme digestion に よ り have ら れ た Fv と with others の binding energy を have す る こ と が.at し た. ま た, H lock Y96F variations (Y96F) の destiny は, WT と comparative low し 1/5 に し て い た. Y96F の NMR analytical の results, WT で 観 measurement さ れ て い た 2 kinds の コ ン ホ メ ー シ ョ ン に 応 seaborne す る NMR シ グ ナ ル が, Y96F で は 観 measuring さ れ な か っ た. し た が っ て, Tyr96 の struck close pollination が, antigen binding site に exist す る tectonic polymorphic phenomenon お よ び binding energy に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

N.Shinba et al: "Determination of Protonation and Deprotonation Forms and Tautomeric States of Histidine Residues in large Proteins Using Nitrogen-Carbon J Couplings in Imidazole Ring" J.Am.Chem.Soc.120. 10988-10989 (1998)

N.Shinba 等人：“使用咪唑环中的氮-碳 J 偶联测定大型蛋白质中组氨酸残基的质子化和去质子化形式以及互变异构状态”J.Am.Chem.Soc.120。