生命システム解明を目指したNMRによる生体分子間相互作用解析法の開発

使用 NMR 开发生物分子相互作用分析方法来阐明生物系统

• 批准号: 14011262
• 负责人: 高橋 栄夫
• 金额: $ 3.14万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011262/
• 关键词: NMR; 蛋白質; 相互作用; 総合界面; 交差飽和

研究代表者らが開発した交差飽和法は、タンパク質複合体の相互作用界面を、これまでにない精度で決定することが可能な手法であるが、その適用にあたっては、高分子量蛋白質複合体におけるスピン拡散を抑制するために、リガンド蛋白質を高度に重水素化することがポイントとなる。しかしながら、これは測定感度の低下を引き起こすことになり、網羅的な相互作用解析に適しているとはいい難かった。本研究では、側鎖メチルプロトンを利用することで、交差飽和法における問題点を克服することを試みた。はじめに、交差飽和実験の計算プログラムを作成し、メチル基の交差飽和実験のシミュレーションを行った。その結果、メチル基特有の回転運動に起因するメチルプロトンのT1が短いという特徴により、交差飽和実験結果に悪影響を与える分子内スピン拡散効果は軽減されることが明らかとなった。実験のモデル系としては、複合体分子量164KのFB-マウスIgG1の系を利用した。メチル基選択的な安定同位体標識は、Kayらにより提案されているILV標識法で行った。照射領域の検討を行い、250ミリ秒の短い照射時間でも相互作用界面に存在するメチルプロトンに、交差飽和による顕著な強度減少が見られたことから、分子間飽和移動の効率は極めて高いことが明らかとなった。さらに、メチルプロトンの短いT1により、繰り返し時間を短縮することが可能であり、アミドプロトン検出(90%重水溶媒条件)の場合に比べ、圧倒的に検出感度は高くなった。特に高分子量蛋白質において、メチルプロトン検出は、TROSYを利用したアミドプロトン検出以上に感度が良いことが知られていることから、本法は高分子量蛋白質複合体の相互作用残基の決定において極めて有効な方法になると考えられる。

Research representatives ら が open 発 し た job saturation method は, タ ン パ ク qualitative complex の interaction interface を, こ れ ま で に な い precision で decided す る こ と が may な gimmick で あ る が, そ の applicable に あ た っ て は, high molecular weight protein complex に お け る ス ピ ン company, scattered を inhibit す る た め に, リ ガ ン ド protein を highly に heavy water element す る こ と Youdaoplaceholder0 がポ トとなる トとなる. し か し な が ら, こ れ は measurement sensitivity low の を lead き up こ す こ と に な り, snare な interaction analytical に し て い る と は い い difficult か っ た. This study で は, side lock メ チ ル プ ロ ト ン を using す る こ と で, a job saturated に お け る problem を overcome す る こ と を try み た. Youdaoplaceholder0 じめに, the cross saturation experiment <s:1> calculation プログラムを is made into プログラムを, メチ メチ basis <s:1> cross saturation experiment シ シ ュレ ショ ショ を を った line った. そ の results, メ チ ル base characteristic motion planning の back に cause す る メ チ ル プ ロ ト ン の short T1 が い と い う, 徴 に よ り, cross saturation be 験 results に 悪 influence を and え る intramolecular ス ピ ン scattered services company, fruit は 軽 minus さ れ る こ と が Ming ら か と な っ た. Experimental <s:1> モデ と series と て て て て, complex molecular weight 164K <s:1> fb-ウ スIgG1 series を using <s:1> た た. Youdaoplaceholder0 メチ selects the な stable isoform identifier of 択, 択, Kayらによ 択 proposal されて る るILV identifier method で line った. Beg を い, 250 brachytherapy の 検 ミ リ seconds short の い irradiation time で も interaction interface に exist す る メ チ ル プ ロ ト ン に, a job saturated に よ る sake な strength reduce が 顕 ら れ た こ と か ら, intermolecular saturated mobile の は sharper rate extremely め て high い こ と が Ming ら か と な っ た. さ ら に, メ チ ル プ ロ ト ン の short い T1 に よ り, Qiao り return し shortening time を す る こ と が may で あ り, ア ミ ド プ ロ ト ン 検 out (90% heavy water solvent condition) に の occasion than べ 圧 fall に 検 out sensitivity high は く な っ た. Special に high molecular weight protein に お い て, メ チ ル プ ロ ト ン 検 は, TROSY を using し た ア ミ ド プ ロ ト ン 検 out above に sensitivity が good い こ と が know ら れ て い る こ と か ら は high molecular weight protein complex, this law の interaction residues の decided に お い て extremely め て have sharper な method に な る と exam え ら れ る.

项目成果

K.Takeuchi et al.: "Solution Structure of ω-Grammotoxin SIA, A Gating Modifier of P/Q and N-type Ca^<2+> Channel"J.Mol.Biol.. 321. 517-526 (2002)

K.Takeuchi等人：“ω-革兰莫毒素SIA的溶液结构，P/Q和N型Ca ^ 2+ 通道的门控修饰剂”J.Mol.Biol.. 321. 517-526 (2002)

T.Nakanishi et al.: "Determination of the interface of a large protein complex by transferred cross-saturation measurements"J.Mol.Biol.. 318. 245-249 (2002)

T.Nakanishi 等人：“通过转移交叉饱和度测量确定大蛋白质复合物的界面”J.Mol.Biol.. 318. 245-249 (2002)

N.Nishida et al.: "Backbone 1H,13C,15N resonance assignments of the von Willebrand factor A3 domain"J.Biomol.NMR. 24. 357-358 (2002)

N.Nishida 等人：“von Willebrand 因子 A3 结构域的主链 1H、13C、15N 共振分配”J.Biomol.NMR。

N.Nishida et al.: "Novel Collagen-Binding Mode of the VWA Domain Determined by a Transferred Cross-Saturation Experiment"Nat.Struct.Biol.. 10. 53-58 (2003)

N.Nishida 等：“通过转移交叉饱和实验确定的 VWA 结构域的新型胶原蛋白结合模式”Nat.Struct.Biol.. 10. 53-58 (2003)